真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化
Summary
種子感染菌による穀物の荒廃は、より良い植物 – 病原体相互作用を理解するための多数の研究努力を求めている。実験室の設定で種子菌の相互作用を研究するために、我々は真菌の繁殖、バイオマス、カーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシン汚染の定量化のための堅牢な方法を開発した。
Abstract
種子感染菌による穀物の腐敗は、人間と動物の健康に深刻なリスクに言及しないように、穀物生産の世界的な最大の経済課題の一つを引き起こします。穀物生産のうち、トウモロコシは穀物の整合性とマイコトキシン汚染種子における病原体によって誘発される損失のため、おそらく最も影響を受けた作物である。トウモロコシ生産者と食品および飼料のプロセッサに2つの最も普及していると問題のマイコトキシンは、それぞれアスペルギルスフラバスとフザリウムverticillioidesによって生成されたアフラトキシンやフモニシン、である。
分子植物-病原体相互作用における最近の研究では、真菌感染症とマイコトキシン汚染1,2,3,4,5,6に対する植物の応答に関連付けられた特定のメカニズムを理解する上で約束を示している。多くのラボでは、植物 – 病原体相互作用を研究するためにカーネルのアッセイを使用しているので、異なる生物学的パラメータを定量化するための標準的な方法の必要性がそう、そこです。別の研究室からの結果はクロスと解釈することができます。種子の定量分析するための堅牢で再現性のある手段のために、私たちは真菌の増殖、バイオマス、マイコトキシン汚染を定量化するためにラボでのカーネル·アッセイおよび後続のメソッドを開発しました。四滅菌トウモロコシのカーネルは、菌の懸濁液（10 6）をガラスバイアルに接種し、所定の期間インキュベートする。サンプルバイアルは、その後、HPLCにより血球、エルゴステロールベースの高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によるバイオマスの分析、AflaTest蛍光法を用いてアフラトキシンの定量化、およびフモニシンの定量化による分生子の列挙のために選択されています。
Protocol
1。トウモロコシカーネルのバイオアッセイ二週間前までに、文化28でポテトデキストロース寒天（PDA）上での真菌病原体℃、 彼らはバイオアッセイバイアルの底レベル、50mlファルコンチューブ内の場所を築くため、好ましくは、平坦化され、同様の大きさと形でカーネルを選択します。選択したカーネルは、類似した種子の年齢及び代謝物の組成を保証するために、同じ環境…
Discussion
<p class="jove_content">ここで説明する方法は広範囲にテストされ、真菌のコロニー形成、減数し、マイコトキシンの生産のための定量的な結果の生成に堅牢であることが証明されています。また、これらのメソッドはmycotoxigenic菌類（例えば、ピーナッツ、小麦、綿花、ピスタチオなど）による汚染の影響を受けやすい他の植物種の種子に適用する必要があります。有能な植物 – 病原体相互作用分析のために、そ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は彼らの技術支援のためにブランドンハセット、カルロス·オルティスに感謝します。この作品は、NSFの助成金IOB-0544428、IOS-0951272、博士マイケルKolomietsにし、食と農の米農務省国立研究所（NIFA）、AFRIの育種と教育グラント＃2010から85117でIOS-0925561によってサポートされていました-20539博士へ。セスマレー、トーマスIsakeit、とマイケルKolomiets。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog # |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientifc | S71659A |
| Tween-20 | Fisher Scientifc | BP337-100 |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 |
| Blender | Vicam | 20200 |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 |
| Afla Test column | Vicam | G1024 |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 |
| Methanol | Vicam | 35016 |
| Acetonitrile | Fisher Scientifc | AC14952-0025 |
| Ethanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientifc | 60108-304 |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g |
| Boric acid | Fisher Scientifc | BP168-500 |
| Sodium borate | Fisher Scientifc | RDCS0330500 |
| Mercaptoethanol | Fisher Scientifc | 45-000-231 |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | LC-20AT |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | RF-10AXL |
| Sodium phosphate | Fisher Scientifc | AC38987-0010 |
| FB1 standards | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg |
| Chloroform | VWR | MK444410 |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Life Science | 4426 |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F |
| Scintillation vials | VWR | 66021-602 |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -. B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus – seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Christensen, S. A. . Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
Tags
QuantificationFungal ColonizationSporogenesisMycotoxinsKernel BioassaysSeed-infecting FungiCereal ProductionMaizePathogen-induced LossesGrain IntegrityMycotoxin Seed ContaminationAflatoxinFumonisinAspergillus FlavusFusarium VerticillioidesMolecular Plant-pathogen InteractionsStandardized MethodQuantifying Biological ParametersCross-interpretationKernel AssaysQuantitative AnalysesFungal GrowthBiomassMycotoxin Contamination
Cite This Article
Christensen, S., Borrego, E., Shim, W., Isakeit, T., Kolomiets, M. Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays. J. Vis. Exp. (62), e3727, doi:10.3791/3727 (2012).