Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis
Summary
Biz aydınlık intravital mikroskopi, in vivo olarak nötrofil kemoatraktan kaynak yanıt nötrofil göçünü sırasında dinamik nötrofil-endotel hücre etkileşimleri ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Nötrofil intraluminal tarama, fare Cremaster'ın kas dokusu transendoteliyal göç ve kemotaksis zaman lapsed video ImageJ ile fotoğraf ve takip ile görüntülendi.
Abstract
Kan akışından iltihaplı doku lökosit dolaşan işe inflamasyon 1,2 önemli ve karmaşık bir süreç. Iltihaplı doku postkapiller venüller, başlangıçta halata ve rulo venüler duvar luminal yüzeyinde lökosit. Endotel lökosit tutuklama Haddeleme ve kemokin veya venüler yüzeyinde diğer chemoattractants yanıt firma yapışma tabi. Birçok yapışık lökositlerin endotel junctional ekstravazasyonu sitesine yapışma ilk sitesinden taşınmaya, intraluminal 3 sürünen bir süreç olarak nitelendirdi. Taramasını takiben, lökosit kemoatraktan, kaynak (kemotaksis) 4 doğru ekstravasküler doku endotel (geçişe) üzerinden hareket ve geçiş yapma. Intravital mikroskopi, in vivo lökosit-endotel hücre etkileşimleri görselleştirme ve lökosit işe 2,5 hücresel ve moleküler mekanizmaları ifşa için güçlü bir araçtır . Bu raporda, aydınlık intravital mikroskopi kullanılarak nötrofil kemoatraktan degrade yanıt fare Cremaster'ın kas nötrofil göçünü ayrıntılı süreçlerini görselleştirmek ve belirlemek için kapsamlı bir açıklama sağlar. Nötrofil göçünü, nötrofil kemoatraktan MIP-2 (CXCL2, CXC kemokin) veya WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, sentetik bir analog içeren agaroz jel küçük bir parça (~ 1 mm 3 boyut) ikna etmek için bakteriyel peptid) gözlenen postkapiller venule komşu kas dokusu yerleştirilir. Zaman-lapsed video fotoğraf ve bilgisayar yazılımı ImageJ, endotele nötrofil transendoteliyal göç ve göç ve doku kemotaksis nötrofil intraluminal sürünerek görüntülenebilmekte ve izlenir. Bu protokol intraluminal sürünerek hızı, âlemden zaman, dekolmanı zaman, göç hızı, kemotaksi hız ve doku kemotaksis indeksi gibi pek çok nötrofil göçünü parametrelerin güvenilir ve kantitatif analiz sağlar. Biz bu protokolü kullanarak, bu nötrofil göçünü parametreleri stabil bir şekilde belirlenir ve tek bir hücre lokomosyon uygun in vivo olarak takip edilebilir olduğunu göstermektedir.
Protocol
Discussion
Intravital mikroskopi inflamasyon sırasında lökosit işe hücresel ve moleküler mekanizmaları ifşa ettiği için önemli bir araçtır. Cremaster'ın kas ve mezenter gibi saydam dokuların mikrodolaşımını lökosit-endotel hücre etkileşimleri tayini için nicel görselleştirme 1,5 tekniğini uygulama için altın standart olmaya devam etmektedir. Geleneksel aydınlık intravital mikroskopi birçok benzersiz teknik özelliklere sahip ve bu dokularda ortaya çıkan işe alma mekanizmaları i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR, MOP-86.749) bir araştırma hibe ile desteklendi. L. Liu CIHR Yeni Araştırmacı Ödülü (MSH 95.374) bir alıcı.
Materials
Table: Materials, Specific Reagents and Equipment
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Polyethylene tubing, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm |
| India ink | Speedball Art | Super Black | 100% carbon black pigment-no dyes |
| Cautery | Aaron Medical | AA03 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murine recombinant MIP-2 | R&D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapure |
| Heparin | Sigma | H-3393 | |
| Upright microscope | Olympus | BX61WI | |
| 3CCD color video camera | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD video recorder | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| TV monitor | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Water circulator | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Peristaltic pump | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscle board | University of Saskatchewan | Home-made |
References
- Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
- Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
- Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
- Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation. Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
