تتبع الزحف داخل اللمعة العدلات ، والهجرة والانجذاب الكيميائي Transendothelial في الأنسجة بواسطة الميكروسكوب فيديو Intravital
Summary
وصفنا على بروتوكول المجهري brightfield intravital لقياس ديناميكية التفاعلات الخلية العدلة البطاني خلال تجنيد العدلة ردا على مصدر جاذب كيميائي العدلة في الجسم الحي. العدلة الزحف داخل اللمعة ، والهجرة وtransendothelial الكيميائي في الأنسجة العضلية الماوس المشمرة وتصور مع التصوير الفيديو وانقضى الوقت مع ImageJ مجنزرة.
Abstract
توظيف تعميم الكريات البيض من مجرى الدم إلى الأنسجة الملتهبة هو عملية حاسمة ومعقدة من 1،2 الالتهابات. في الوريدات شعيرة وريدية من الأنسجة الملتهبة ، الكريات البيض في البداية حبل ولفة على سطح الجدار وريدي اللمعية. المتداول الكريات البيضاء القبض على التصاق البطانة والخضوع الشركة استجابة لchemokine chemoattractants أو أخرى على السطح وريدي. ووصف عملية نقل العديد من الكريات البيض ملتصق من موقع الأولي للانضمام الى موقع التسرب صلي في البطانة ، داخل اللمعة الزحف 3. التالية الزحف والتحرك عبر بطانة الكريات البيض (التهجير) وتهاجر في أنسجة خارج الأوعية نحو مصدر جاذب كيميائي (الكيميائي) 4. Intravital المجهر هو أداة قوية لتصور التفاعلات خلية الكريات البيض في الجسم الحي البطاني وكشف الآليات الخلوية والجزيئية للتجنيد 2،5 الكريات البيض. في هذا التقرير ، ونحن نقدم وصفا شاملا لاستخدام brightfield intravital المجهري لتصور وتحديد العمليات التفصيلية للتجنيد في العضلات العدلة المشمرة الماوس ردا على التدرج من جاذب كيميائي العدلة. للحث على تجنيد العدلة ، وقطعة صغيرة من هلام agarose (~ 1 ملم 3 الحجم) التي تحتوي على جاذب كيميائي العدلة MIP – 2 (CXCL2 ، وهو chemokine CXC) أو WKYMVm (التربتوفان ، اليس ، صور ، فال – D – الأرصاد الجوية ، والتناظرية الاصطناعية يوضع من الببتيد الجرثومي) على الأنسجة العضلية المجاورة للشعيرة وريدية في الوريد ملاحظتها. مع مرور الوقت ، ساقطا التصوير الفوتوغرافي والفيديو وبرامج الكمبيوتر ImageJ ، العدلة الزحف داخل اللمعة على البطانة ، والهجرة transendothelial العدلة والهجرة والكيميائي في الأنسجة وتصور ومجنزرة. هذا البروتوكول يسمح التحليل الكمي وموثوق بها العديد من المعلمات التوظيف العدلة مثل سرعة الزحف داخل اللمعة ، والوقت التهجير ، مفرزة الوقت والسرعة والهجرة ، وسرعة الكيميائي والكيميائي المؤشر في الأنسجة. علينا أن نظهر أن استخدام هذا البروتوكول ، ويمكن توظيف هذه المعلمات العدلة تحديد ستابلي وتنقل خلية واحدة تتبع بسهولة في الجسم الحي.
Protocol
Discussion
Intravital المجهر هو أداة أساسية للكشف عن الآليات الخلوية والجزيئية لتجنيد الكريات البيض خلال الالتهاب. التصور الكمي لتحديد التفاعلات خلية الكريات البيض البطاني في الأنسجة microvasculature transluscent مثل العضلات والمشمرة مساريق تبقى المعيار الذهبي لتطبيق هذه التقنية 1،5. وintr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة بحثية من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CIHR ، MOP – 86749). L. ليو هي المستفيدة من جائزة CIHR محقق جديد (MSH – 95374).
Materials
Table: Materials, Specific Reagents and Equipment
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Polyethylene tubing, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm |
| India ink | Speedball Art | Super Black | 100% carbon black pigment-no dyes |
| Cautery | Aaron Medical | AA03 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murine recombinant MIP-2 | R&D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapure |
| Heparin | Sigma | H-3393 | |
| Upright microscope | Olympus | BX61WI | |
| 3CCD color video camera | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD video recorder | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| TV monitor | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Water circulator | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Peristaltic pump | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscle board | University of Saskatchewan | Home-made |
References
- Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
- Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
- Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
- Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation. Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
