Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo
Summary
Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d'un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.
Abstract
Le recrutement des leucocytes circulants à partir du flux sanguin vers les tissus enflammés est un processus crucial et complexe de 1,2 inflammation. Dans le veinules post des tissus enflammés, les leucocytes d'abord d'attache et rouler sur la surface luminale de veinules mur. Rouler arrestation leucocytes sur l'endothélium et subissent adhésion ferme en réponse à chimiokine ou chimiotactiques autre sur la surface des veinules. Beaucoup de leucocytes adhérents relocaliser sur le site initial de l'adhésion au site d'extravasation jonctionnelle dans l'endothélium, un processus appelé intraluminale ramper 3. Suite à ramper, se déplacer à travers l'endothélium des leucocytes (transmigration) et migrent dans les tissus extravasculaires vers la source de chimiotactique (chimiotactisme) 4. Microscopie intravitale est un outil puissant pour la visualisation des interactions leucocytes-endothélium in vivo et révèle les mécanismes cellulaires et moléculaires du recrutement des leucocytes 2,5. Dans ce rapport, nous fournissons une description détaillée de l'utilisation de la microscopie intravitale fond clair de visualiser et de déterminer le processus détaillé de recrutement des neutrophiles chez la souris crémaster muscle en réponse à la pente d'un facteur chimiotactique des neutrophiles. Pour induire le recrutement de neutrophiles, un petit morceau de gel d'agarose (~ 1 mm 3 dimensions) contenant chimiotactique des neutrophiles MIP-2 (CXCL2, une chimiokine CXC) ou WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, un analogue synthétique des peptides bactériens) est placé sur le tissu musculaire adjacent à la veinule observés postcapillaires. Avec le temps écoulé, la photographie vidéo et l'ordinateur le logiciel ImageJ, neutrophiles ramper intraluminale sur l'endothélium, la migration des neutrophiles transendothéliale et de la migration et le chimiotactisme dans les tissus sont visualisés et suivis. Ce protocole permet une analyse fiable et quantitative de nombreux paramètres tels que le recrutement de neutrophiles vitesse de ramper intraluminale, le temps de la transmigration, le temps de détachement, la vitesse de migration, la vitesse et l'indice de chimiotactisme chimiotactisme dans les tissus. Nous démontrons que l'utilisation de ce protocole, ces paramètres peuvent être le recrutement de neutrophiles stable déterminée et la locomotion cellule unique commodément suivi in vivo.
Protocol
Discussion
Microscopie intravitale est l'outil indispensable pour révéler les mécanismes cellulaires et moléculaires de recrutement des leucocytes pendant l'inflammation. La visualisation quantitative pour la détermination des interactions leucocytes-endothélium dans les microvaisseaux des tissus translucides tels que le muscle crémaster et le mésentère reste le gold standard pour l'application de la technique de 1,5. La microscopie à fond clair conventionnels intravitale a beaucoup uniques caract?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche des Instituts canadiens de recherche en santé (IRSC, la RdP-86 749). L. Liu est récipiendaire du Prix de nouveau chercheur des IRSC (MSH-95374).
Materials
Table: Materials, Specific Reagents and Equipment
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Polyethylene tubing, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm |
| India ink | Speedball Art | Super Black | 100% carbon black pigment-no dyes |
| Cautery | Aaron Medical | AA03 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murine recombinant MIP-2 | R&D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapure |
| Heparin | Sigma | H-3393 | |
| Upright microscope | Olympus | BX61WI | |
| 3CCD color video camera | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD video recorder | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| TV monitor | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Water circulator | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Peristaltic pump | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscle board | University of Saskatchewan | Home-made |
References
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