추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis
Summary
우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 – 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.
Abstract
혈류에서 염증 조직 leukocytes 순환의 모집은 염증의 1,2의 결정과 복잡한 프로세스입니다. 염증 조직의 postcapillary venules에서 venular 벽 luminal 표면에 처음에는 밧줄과 롤 leukocytes. 내피에 leukocytes 연금을 롤백하고 케모카인 또는 venular 표면에 다른 chemoattractants에 대한 응답으로 확고한 접착력을 받고있다. 많은 자기편 leukocytes이 내피에있는 junctional 넘쳐 흐름 사이트에 부착의 초기 사이트에서 재배치, 프로세스 intraluminal 3를 크롤 링 칭했다. 크롤링 다음, leukocytes는 chemoattractant의 소스 (chemotaxis) 4쪽으로 extravascular 조직에서 내피 (윤회)를 통해 이동하고 마이 그 레이션. Intravital 현미경은 생체내에서 백혈구 – 내피 세포 상호 작용을 시각화하고 백혈구 모집 2,5의 세포 및 분자 메커니즘을 드러내는위한 강력한 도구입니다. 이 보고서에서는, 우리는 호중구 chemoattractant의 경사도에 대응 마우스 cremaster 근육에서 호중구 모집의 세부 프로세스를 시각화하고 결정하는 brightfield intravital 현미경을 사용하는 포괄적인 설명을 제공합니다. 호중구 채용, 호중구 chemoattractant MIP – 2 (CXCL2, CXC의 케모카인) 또는 WKYMVm (TRP – LYS – 티르 – 발 – D – 만났고, 합성 아날로그를 포함한 아가로 오스 겔의 작은 조각 (~ 1 mm 3 크기)를 유도하기 위해 세균성 펩타이드의)는 관찰 postcapillary venule에 인접한 근육 조직에 배치됩니다. 시간 타락한 비디오 촬영 및 컴퓨터 소프트웨어 ImageJ, 내피, 호중구 transendothelial 마이 그 레이션 및 조직에서 마이 그 레이션 및 chemotaxis에 호중구 intraluminal 크롤 링 시각 및 추적과 함께. 이 프로토콜은 intraluminal 크롤링 속도, 윤회 시간, 분리 시간, 마이 그 레이션 속도, chemotaxis 속도와 조직의 chemotaxis 지수 많은 호중구 모집 매개 변수의 신뢰성 및 정량 분석이 가능합니다. 우리는이 프로토콜을 사용하여 이러한 호중구 모집 매개 변수가 안정적으로 결정하고 단세포 운동이 편리 생체내에서 추적할 수있다는 것을 보여준다.
Protocol
Discussion
Intravital 현미경은 염증시 백혈구 모집의 세포 및 분자 메커니즘을 밝히 위해 필수적인 도구입니다. 이러한 cremaster 근육 및 장간막과 같은 transluscent 조직의 microvasculature에서 백혈구 – 내피 세포 상호 작용의 결정에 대한 양적 시각화의 기법 1.5의 응용 프로그램에 대한 황금 표준 남아 있습니다. 기존 brightfield의 intravital 현미경은 많은 독특한 기술 특징을 가지고 있으며, 이들 조직에서 공?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 연구 캐나다 연구소 (CIHR, 걸레 – 86749)에서 연구 부여에 의해 지원되었다. L. 리우 CIHR 새로운 탐정 수상 (MSH – 95374)의 수상자이다.
Materials
Table: Materials, Specific Reagents and Equipment
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Polyethylene tubing, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm |
| India ink | Speedball Art | Super Black | 100% carbon black pigment-no dyes |
| Cautery | Aaron Medical | AA03 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murine recombinant MIP-2 | R&D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapure |
| Heparin | Sigma | H-3393 | |
| Upright microscope | Olympus | BX61WI | |
| 3CCD color video camera | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD video recorder | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| TV monitor | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Water circulator | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Peristaltic pump | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscle board | University of Saskatchewan | Home-made |
References
- Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
- Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
- Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
- Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation. Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
