Summary

Diagnóstico rápido de vírus da gripe aviária em aves selvagens: o uso de um Portable rRT-PCR e liofilizados Reagentes no Campo

Published: August 02, 2011
doi:

Summary

Este estudo descreve o diagnóstico de influenza aviária em aves selvagens usando um sistema rRT-PCR portátil. O método aproveita liofilizadas reagentes para a tela aves selvagens em um ambiente não-laboratorial, típico de um cenário de surto. Uso de ferramentas moleculares oferece alternativas precisas e sensíveis para o diagnóstico rápido.

Abstract

Aves selvagens têm sido implicados na disseminação da Gripe aviária altamente patogénica (GAAP) do subtipo H5N1, o que levou a vigilância ao longo de rotas migratórias. Amostragem de aves selvagens para o vírus da gripe aviária (AIV) é muitas vezes realizado em regiões remotas, mas os resultados são muitas vezes adiada devido à necessidade de transportar amostras para um laboratório equipado para o teste molecular. Em tempo real da transcriptase reversa reação em cadeia da polimerase (PCR rRT-) é uma técnica molecular que oferece um dos métodos mais precisos e sensíveis para o diagnóstico de AIV. Os protocolos de laboratório anteriormente estritamente necessário para rRT-PCR estão sendo adaptados para o campo. Desenvolvimento de reagentes liofilizados (liofilizado) que não exigem cadeia de frio, com sensibilidade ao nível dos reagentes molhada trouxe o teste no local remoto a um objetivo prático.

Aqui apresentamos um método para o diagnóstico rápido de AIV em aves selvagens usando uma unidade rRT-PCR (Dispositivo de Identificação Ruggedized avançada de patógenos ou RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT), que emprega reagentes liofilizados (Influenza A Meta 1 Taqman; Asay ASY-0109-, Idaho Technologies). Os reagentes contêm todos os componentes necessários para o teste em concentrações adequadas, em um único tubo: primers, sondas, enzimas, amortecedores e controles positivos internos, eliminando erros associados com o armazenamento inadequado ou manuseio de reagentes molhado. A unidade portátil executa uma tela para Influenza A, visando o gene matriz e produz resultados em 2-3 horas. Subtipagem genética também é possível com primer H5 e H7 conjuntos que visam o gene hemaglutinina.

O sistema é adequado para uso coletadas de aves selvagens, como demonstrado aqui sobre as espécies migratórias shorebird, o maçarico ocidental (Calidrus mauri) capturado no norte da Califórnia. Em amostras de cloaca e orofaringe Manuseio dos animais seguiu protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care e Uso do Geological Survey Research Centro Oeste dos EUA e permite Ecológica do Pássaro Serviço Geológico dos EUA Banding Laboratory. A principal vantagem desta técnica é para agilizar o diagnóstico das aves selvagens, aumentando as chances de conter um surto em um local remoto. No local, o diagnóstico também ser útil para identificar e estudar os indivíduos infectados em populações selvagens. A oportunidade para coletar informações sobre a biologia do hospedeiro (resposta imunológica à infecção e fisiológicas) e ecologia espacial (performance migratória de aves infectadas) fornecerá insights sobre a medida em que as aves selvagens podem atuar como vetores para AIV a longas distâncias.

Protocol

1. Captura de aves selvagens usando redes de neblina Para a captura de shorebird, configurar redes de neblina em um sítio ativo de forrageamento como um pântano, costa, ou lama plana. Deslize linha de tresmalho loops de uma extremidade da rede de neblina em torno do pólo e inserir pole verticalmente em lama. Estende a net, insira segundo pólo através de loops de tresmalho na outra extremidade da rede de neblina e verticalmente inserir pole em lama, certificando-se que as linhas de tre…

Discussion

O método de diagnóstico rápido aqui apresentados facilita os testes de tempo eficiente e preciso de amostras de aves selvagens para a vigilância de AIV. Os requisitos espécime muito menos rigorosas de armazenamento portátil de rRT-PCR são adequadas para situações remotas, onde a manutenção de uma cadeia de frio pode ser impraticável se carregadores de nitrogênio líquido ou gelo seco não está disponível. Além disso, descobrimos que a análise da amostra com os reagentes liofilizados foi suficientemente …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Queremos agradecer Scullion M. e R. Crisp de Idaho Technologies para o suporte técnico eo USGS ocidental Centro de Pesquisa Ecológica de financiamento (S. Schwarzbach) e assistência (K. Spragens, T. Graham). Esta pesquisa foi realizada sob os auspícios do Centro para Inovação Tecnológica – Instituto de Defesa e Segurança Interna (www.idhs.org), em apoio ao Departamento de Defesa e Laboratório de Pesquisas da Força Aérea. Manuseio dos animais seguiu protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care e Uso do Geological Survey Research Centro Oeste dos EUA e permite Ecológica do Pássaro Serviço Geológico dos EUA Banding Laboratory. Qualquer uso do comércio, produto ou empresa nomes nesta publicação é apenas para fins descritivos e não implica o endosso pelo governo dos EUA.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
RNeasy mini spin column Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Collection tubes (1.5 & 2 mL) Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RLT Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RW1 Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RPE Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
RNase-free water Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
14.3 M β-mercaptoethanol solution Fisher Scientific BP176100  
100% ethanol Fisher Scientific NC9602322  
Vortex Genie 2, 120V Scientific Industries SI-0236  
Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) Idaho Technologies ASAY-ASY-0109  
Lightcycler 20ml capillary tubes Roche Applied Science 04929292001  
Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Pentium-based laptop with Windows XP Professional Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Lightcycler Data Analysis software Idaho Technologies   Included in RAPID kit

References

  1. Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
  2. Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
  3. Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
  4. Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
  5. Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
  6. Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
  7. Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
  8. Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
  9. Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections.. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
  10. . OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
  11. Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
  12. Kim, J. -. K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the “Trojan Horses” of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
  13. Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).

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Cite This Article
Takekawa, J. Y., Hill, N. J., Schultz, A. K., Iverson, S. A., Cardona, C. J., Boyce, W. M., Dudley, J. P. Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field. J. Vis. Exp. (54), e2829, doi:10.3791/2829 (2011).

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