Summary

אבחון מהיר של וירוס שפעת העופות בעופות בר: שימוש ניידים rRT-PCR ו מיובשים בהקפאה ריאגנטים בתחום

Published: August 02, 2011
doi:

Summary

מחקר זה מתאר את האבחנה של שפעת העופות בעופות בר באמצעות מערכת ניידת rRT-PCR. השיטה מנצלת מיובשים בהקפאה ריאגנטים למסך ציפורי בר בסביבה הלא במעבדה, תרחיש טיפוסי של התפרצות. שימוש בכלים מולקולריים מספק חלופות מדויק ורגיש לאבחון מהיר.

Abstract

ציפורי בר היו מעורבים התפשטות שפעת העופות מאוד פתוגניים (HPAI) של תת סוג H5N1, שגרם מעקב לאורך flyways נודדות. דגימה של ציפורי בר וירוס שפעת העופות (AIV) מתנהל לעתים קרובות באזורים נידחים, אבל התוצאות הן לעתים קרובות מתעכב בשל הצורך להעביר דגימות למעבדה מצויד לבדיקה מולקולרית. בזמן אמת transcriptase הפוכה polymerase תגובת שרשרת (rRT-PCR) היא טכניקה מולקולרית המציע אחת השיטות המדויקות ביותר ורגישה לאבחון של AIV. פרוטוקולים המעבדה קפדנית בעבר הדרושים rRT-PCR כיום להיות מותאמים עבור השדה. פיתוח של חומרים כימיים מיובשים בהקפאה (lyophilized) שאינם דורשים שרשרת קר, עם רגישות ברמה של ריאגנטים רטוב הביא באתר בדיקות מרחוק מטרה מעשית.

כאן אנו מציגים שיטה לאבחון מהיר של AIV בעופות בר באמצעות יחידת rRT-PCR (מכשיר מתקדם Ruggedized זיהוי הפתוגן או RAPID, איידהו טכנולוגיות, סולט לייק סיטי, יוטה) המעסיקה ריאגנטים lyophilized (1 שפעת יעד TaqMan; ASAY -ASY-0109, איידהו טכנולוגיות). ריאגנטים להכיל את כל המרכיבים הדרושים לצורך בדיקות בריכוזים המתאימים שפופרת אחת: primers, בדיקות, אנזימים, מאגרים בקרות פנימיות חיוביות, ביטול שגיאות הקשורות אחסון לא נכון או טיפול של ריאגנטים רטוב. יחידה ניידת מבצע מסך לשפעת על ידי מיקוד הגן מטריצה ​​והתשואות תוצאות 2-3 שעות. Subtyping גנטית אפשר גם עם פריימר H5 ו – H7 קובע כי היעד של הגן hemagglutinin.

המערכת הוא מתאים לשימוש על דגימות ביוב ו הלוע התחתון שנאספו ציפורי בר, כפי שהודגם כאן על מינים נודדים shorebird, ביצנית המערבי (Calidrus mauri) כבשו בצפון קליפורניה. טיפול בבעלי חיים בעקבות הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש הגיאולוגי בארה"ב סקר המערבי מרכז מחקר אקולוגי והיתרים של בירד בארה"ב סקר גיאולוגי banding מעבדה. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא לזרז את האבחון של ציפורי בר, ​​להגדיל את הסיכויים של המכיל התפרצות במיקום מרוחק. באתר אבחנה גם להיות שימושי עבור זיהוי לומדים אנשים נגועים באוכלוסיות הבר. ההזדמנות לאסוף מידע על הביולוגיה מארח (בתגובה החיסונית לזיהום פיזיולוגיים) ואקולוגיה מרחבית (ביצועים הנדידה של עופות נגועים) יספק תובנות המידה שבה ציפורי בר יכולים לשמש וקטורים עבור AIV על פני מרחקים ארוכים.

Protocol

1. ציפור ללכוד Wild באמצעות רשתות ערפל עבור ללכוד shorebird, להקים רשתות ערפל באתר ליקוט פעיל כגון ביצה, קו החוף, או בוץ שטוח. קו שקופיות מכמורת לולאות בקצה אחד של הרשת ערפל סביב הקוטב והכנס מוט אנכי?…

Discussion

שיטת אבחון מהיר המוצג כאן מאפשר בדיקה זמן יעיל ומדויק של דגימות צפור פראית למעקב של AIV. אחסון הרבה פחות מחמירים הדגימה דרישות ניידים rRT-PCR מתאים למצבים מרוחקים שבהם תחזוקה של רשת קר עשוי להיות מעשי אם משלחים חנקן נוזלי או קרח יבש אינו זמין. בנוסף, מצאנו כי ניתוח דגימה עם…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מבקשים להודות מ משרתים ור קריספ איידהו טכנולוגיות תמיכה טכנית המערבי USGS מרכז אקולוגי מחקר למימון (ס Schwarzbach) וסיוע (ק Spragens, ט 'גרהם). מחקר זה נערך תחת חסותו של המרכז לטכנולוגיה חדשנית – המכון לחקר הביטחון לביטחון פנים (www.idhs.org), תמיכה של משרד ההגנה ואת חיל האוויר במעבדת המחקר. טיפול בבעלי חיים בעקבות הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש הגיאולוגי בארה"ב סקר המערבי מרכז מחקר אקולוגי והיתרים של בירד בארה"ב סקר גיאולוגי banding מעבדה. כל שימוש בשמות המסחר, מוצר או חברה בפרסום זה נועד למטרות תיאורי בלבד, אינה מעידה על אישור על ידי ממשלת ארה"ב.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
RNeasy mini spin column Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Collection tubes (1.5 & 2 mL) Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RLT Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RW1 Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RPE Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
RNase-free water Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
14.3 M β-mercaptoethanol solution Fisher Scientific BP176100  
100% ethanol Fisher Scientific NC9602322  
Vortex Genie 2, 120V Scientific Industries SI-0236  
Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) Idaho Technologies ASAY-ASY-0109  
Lightcycler 20ml capillary tubes Roche Applied Science 04929292001  
Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Pentium-based laptop with Windows XP Professional Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Lightcycler Data Analysis software Idaho Technologies   Included in RAPID kit

References

  1. Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
  2. Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
  3. Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
  4. Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
  5. Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
  6. Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
  7. Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
  8. Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
  9. Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections.. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
  10. . OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
  11. Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
  12. Kim, J. -. K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the “Trojan Horses” of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
  13. Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).

Play Video

Cite This Article
Takekawa, J. Y., Hill, N. J., Schultz, A. K., Iverson, S. A., Cardona, C. J., Boyce, W. M., Dudley, J. P. Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field. J. Vis. Exp. (54), e2829, doi:10.3791/2829 (2011).

View Video