Summary

التشخيص السريع لفيروس انفلونزا الطيور في الطيور البرية : استخدام لPCR - RRT المحمولة والكواشف تجميد المجفف في الميدان

Published: August 02, 2011
doi:

Summary

توضح هذه الدراسة تشخيص أنفلونزا الطيور في الطيور البرية المحمولة باستخدام RRT – PCR النظام. الأسلوب يستفيد من تجميد المجفف الكواشف لفحص الطيور البرية في وضع غير مختبر ، نموذجية من سيناريو الفاشية. استخدام الأدوات الجزيئية يوفر بدائل دقيقة وحساسة للتشخيص السريع.

Abstract

وقد تسببت الطيور البرية في انتشار أنفلونزا الطيور عالية الإمراض (HPAI) من سلالة H5N1 ، مما دفع المراقبة على طول مسارات طيران المهاجرة. غالبا ما يجري أخذ عينات من الطيور البرية لفيروس انفلونزا الطيور (AIV) في المناطق النائية ، ولكن النتائج غالبا ما تتأخر بسبب الحاجة لنقل العينات الى مختبر مجهز لاختبار الجزيئية. في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة العكسية الناسخ (RRT – PCR) هي تقنية الجزيئية التي يقدم واحدة من الأساليب الأكثر دقة وحساسية لتشخيص AIV. هي الآن بروتوكولات صارمة من قبل المختبر اللازمة لRRT – PCR يجري تكييفها للحقل. وأدى تطوير كواشف تجميد المجفف (مجفف بالتجميد) التي لا تتطلب سلسلة التبريد ، مع حساسية على مستوى الكواشف الرطب على موقع الاختبار بعيد إلى هدف عملي.

هنا نقدم طريقة للتشخيص السريع للAIV في الطيور البرية باستخدام وحدة RRT – PCR (جهاز صدمات القوية المتقدمة تحديد مسببات الأمراض أو السريع ، وايداهو تكنولوجيز ، سولت لايك سيتي ، UT) التي توظف الكواشف مجفف بالتجميد (الأنفلونزا من الهدف 1 Taqman ؛ الاساي ASY – 0109 – ، ايداهو تكنولوجيز). الكواشف تحتوي على كافة المكونات الضرورية لاختبار بتركيزات مناسبة في أنبوب واحد : الاشعال ، وتحقيقات ، والإنزيمات ، ومخازن والضوابط الإيجابية الداخلية ، والقضاء على الأخطاء المرتبطة التخزين غير لائق أو التعامل مع الكواشف الرطب. وحدة محمولة ينفذ الشاشة لمكافحة الأنفلونزا من خلال استهداف الجينات مصفوفة وتعطي نتائج في غضون 2-3 ساعات. التصنيف الفرعي الوراثية من الممكن أيضا مع التمهيدي H5 و H7 مجموعات التي تستهدف الجين راصة دموية.

هذا النظام هو مناسب للاستخدام على عينات جمعت المذرقية والفم والبلعوم من الطيور البرية ، كما يتضح هنا على الأنواع المهاجرة shorebird ، والطيطوي الغربية (Calidrus ماوري) اعتقل في ولاية كاليفورنيا الشمالية. ثم التعامل مع الحيوانات البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان واستخدام الولايات المتحدة للمسح الجيولوجي الغربية مركز البحوث البيئية وتصاريح من الهيئة الامريكية للمسح الجيولوجي الطيور مختبر التطويق. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو تسريع التشخيص من الطيور البرية ، وزيادة فرص احتواء تفشي هذا المرض في مكان بعيد. وعلى موقع التشخيص يكون مفيدا أيضا لتحديد ودراسة الأشخاص المصابين في الأنواع البرية. سيكون فرصة لجمع المعلومات عن الأحياء المضيف (الاستجابة المناعية والفسيولوجية للإصابة) ، والبيئة المكانية (أداء المهاجرة من الطيور المصابة) توفير نظرة ثاقبة على مدى الطيور البرية يمكن أن تكون بمثابة موجهات لAIV لمسافات طويلة.

Protocol

1. الطيور البرية التقاط باستخدام الشباك الضباب لالتقاط shorebird ، وإنشاء شبكات في ضباب موقعا نشطا العلف مثل المستنقعات ، الشاطئ ، أو الطين المسطحة. المثلثة الشريحة من خط حلقات واحدة من نهاية صا?…

Discussion

طريقة التشخيص السريع المطروحة هنا يسهل اختبار الزمن كفاءة ودقة من عينات الطيور البرية لمراقبة AIV. تخزين العينات أقل صرامة بكثير من متطلبات المحمولة RRT – PCR هي مناسبة للحالات النائية حيث الحفاظ على سلسلة التبريد قد يكون غير عملي إذا الشاحنين النتروجين السائل أو الثلج ا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر M. R. كريسب Scullion وتكنولوجيات ايداهو للحصول على الدعم التقني والأبحاث البيئية الغربية مركز المسح الجيولوجي الأميركية للحصول على تمويل (S. Schwarzbach) والمساعدة (K. Spragens ، T. غراهام). وقد أجريت هذه الدراسة تحت رعاية مركز للتكنولوجيا المبتكرة — معهد الدفاع والأمن الداخلي (www.idhs.org) ، وبدعم من وزارة الدفاع والطيران مختبر أبحاث سلاح. ثم التعامل مع الحيوانات البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان واستخدام الولايات المتحدة للمسح الجيولوجي الغربية مركز البحوث البيئية وتصاريح من الهيئة الامريكية للمسح الجيولوجي الطيور مختبر التطويق. أي استخدام الأسماء التجارية ، والمنتج ، أو شركة في هذا المنشور هو لأغراض وصفية فقط ولا تعبر عن تأييد من قبل الحكومة الامريكية.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
RNeasy mini spin column Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Collection tubes (1.5 & 2 mL) Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RLT Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RW1 Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RPE Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
RNase-free water Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
14.3 M β-mercaptoethanol solution Fisher Scientific BP176100  
100% ethanol Fisher Scientific NC9602322  
Vortex Genie 2, 120V Scientific Industries SI-0236  
Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) Idaho Technologies ASAY-ASY-0109  
Lightcycler 20ml capillary tubes Roche Applied Science 04929292001  
Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Pentium-based laptop with Windows XP Professional Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Lightcycler Data Analysis software Idaho Technologies   Included in RAPID kit

References

  1. Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
  2. Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
  3. Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
  4. Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
  5. Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
  6. Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
  7. Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
  8. Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
  9. Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections.. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
  10. . OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
  11. Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
  12. Kim, J. -. K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the “Trojan Horses” of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
  13. Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).

Play Video

Cite This Article
Takekawa, J. Y., Hill, N. J., Schultz, A. K., Iverson, S. A., Cardona, C. J., Boyce, W. M., Dudley, J. P. Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field. J. Vis. Exp. (54), e2829, doi:10.3791/2829 (2011).

View Video