Summary

野鳥の鳥インフルエンザウイルスの迅速な診断:フィールドのポータブルRRT - PCR及び凍結乾燥試薬の使用

Published: August 02, 2011
doi:

Summary

本研究では、ポータブルRRT – PCRシステムを使用して、野鳥における鳥インフルエンザの診断について説明します。方法は、アウトブレイクのシナリオの典型的な非実験室の設定で野鳥をスクリーニングするために凍結乾燥試薬、を活用しています。分子ツールの使用は、迅速な診断のための正確かつ敏感な選択肢を提供します。

Abstract

野生の鳥は渡り鳥フライウェイに沿って監視を促す、H5N1亜型の高病原性鳥インフルエンザ(HPAI)の拡散に関与している。鳥インフルエンザウイルス(AIV)のための野鳥のサンプリングは、多くの場合、遠隔地で行われているが、結果はしばしば分子検査のために装備研究所にサンプルを輸送する必要が遅延されています。リアルタイムの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RRT – PCR)は、AIVの診断のための最も正確で高感度のいずれかの方法を提供する分子技術です。 RRT – PCRに必要な以前に厳格な実験室のプロトコルは現在、フィールドに適応されている。ウェット試薬のレベルでの感度を持つコールドチェーンを必要としないフリーズドライ(凍結乾燥)試薬の開発は、実用的な目標に、サイト上のリモートテストをもたらしています。

ここでは、凍結乾燥試薬を採用したRRT – PCRユニット(高耐久性高度病原体識別装置またはRAPID、アイダホテクノロジー、ソルトレイクシティ、ユタ州)(インフルエンザターゲット1タックマンを使用して野鳥のAIVの迅速な診断のための方法を提示する。Asay氏を – ASY – 0109、アイダホテクノロジーズ)。不適切な保管やウェット試薬の取り扱いに関連するエラーを排除し、プライマー、プローブ、酵素、緩衝液および内部陽性対照:試薬は、単一のチューブ内で適切な濃度でテストするために必要なすべてのコンポーネントが含まれています。ポータブルユニットは、2〜3時間でマトリックスの遺伝子と収量の結果を標的とすることでインフルエンザのための画面を実行します。遺伝的サブタイピングは、H5やH7プライマーでも可能です、そのターゲットの血球凝集素遺伝子を設定します。

システムは、渡り鳥シギチドリ類の種をここに示すように、野生の鳥から採取した、ヒメハマシギ(Calidrusマウリ 、カリフォルニア北部でキャプチャされた総排泄腔と咽頭サンプルの使用に適しています。動物の扱いは、米国地質調査所西部生態学研究センターと実験室をバンディング米国地質調査所の鳥の許可の動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従った。この技法の主な利点は、遠隔地での発生を含んでいる可能性を高める、野鳥の診断を促進することです。オンサイト診断も、野生の個体群に感染した個体を識別し、研究するために有用であることが分かるでしょう。ホストの生物学(感染症に対する免疫学的および生理学的応答)と空間的な生態学(感染した鳥の渡り​​鳥パフォーマンス)に関する情報を収集する機会は、野生の鳥が長距離のAIVのためのベクターとして動作できる範囲についての洞察を提供します。

Protocol

1。ミストのネットを使用して野生の鳥の捕獲シギチドリ類の捕獲の場合は、このような湿地、海岸線、または干潟のようなアクティブな採餌場所でミストネットを設定する。 スライドトランメルのラインは、ポールの周りに霧のネットの一端のループと泥に垂直にポールを挿入します。 ネットを伸ばし、ミストのネットの他の端にトランメルのループを介し番目の極?…

Discussion

ここで紹介する迅速な診断の方法は、AIVのサーベイランスのための野生の鳥のサンプルの時間効率と正確なテストを容易にします。液体窒素の荷主またはドライアイスが使用できない場合は、コールドチェーンの維持が不可能な場合がありますどこポータブルRRT – PCRのはるかに少ない厳しい試料のストレージ要件は、リモートの状況に適しています。さらに、我々は実験室ベースの分子解析?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、資金調達(S.シュワルツ)と援助(K. Spragens、T.グラハム)のための技術サポートとUSGS西部生態研究センターのためにM.皿洗いとアイダホテクノロジーのR.クリスプを感謝したい。防衛や空軍研究所の部門の支援の防衛と国土安全保障研究所(www.idhs.org)、 – この研究は、革新的技術センターの後援の下に行われた。動物の扱いは、米国地質調査所西部生態学研究センターと実験室をバンディング米国地質調査所の鳥の許可の動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従った。この出版物の貿易、製品、または企業の名前のいずれかを使用するには、説明の提供のみを目的としており、米国政府による是認を意味するものではありません。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
RNeasy mini spin column Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Collection tubes (1.5 & 2 mL) Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RLT Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RW1 Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RPE Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
RNase-free water Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
14.3 M β-mercaptoethanol solution Fisher Scientific BP176100  
100% ethanol Fisher Scientific NC9602322  
Vortex Genie 2, 120V Scientific Industries SI-0236  
Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) Idaho Technologies ASAY-ASY-0109  
Lightcycler 20ml capillary tubes Roche Applied Science 04929292001  
Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Pentium-based laptop with Windows XP Professional Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Lightcycler Data Analysis software Idaho Technologies   Included in RAPID kit

References

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Cite This Article
Takekawa, J. Y., Hill, N. J., Schultz, A. K., Iverson, S. A., Cardona, C. J., Boyce, W. M., Dudley, J. P. Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field. J. Vis. Exp. (54), e2829, doi:10.3791/2829 (2011).

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