Summary

Diagnostic rapide du virus de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages: L'utilisation d'un portable RT-PCR et lyophilisés réactifs dans le domaine

Published: August 02, 2011
doi:

Summary

Cette étude décrit le diagnostic de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages en utilisant un portable RT-PCR système. La méthode tire parti des réactifs lyophilisés à l'écran les oiseaux sauvages dans un cadre non-laboratoire, typique d'un scénario d'épidémie. L'utilisation d'outils moléculaires fournit des solutions de rechange précise et sensible pour le diagnostic rapide.

Abstract

Les oiseaux sauvages ont été impliqués dans la propagation de l'influenza aviaire hautement pathogène (IAHP) de sous-type H5N1, ce qui incite de surveillance le long des voies migratoires. L'échantillonnage des oiseaux sauvages du virus de la grippe aviaire (AIV) est souvent menée dans des régions éloignées, mais les résultats sont souvent retardées en raison de la nécessité de transporter les échantillons à un laboratoire équipé pour des tests moléculaires. En temps réel de la transcriptase inverse de la chaîne par polymérase (RT-PCR) est une technique moléculaire qui offre l'une des méthodes les plus précises et sensibles pour le diagnostic de l'AIV. Les protocoles de laboratoire préalablement strict nécessaire pour la RT-PCR sont maintenant adaptés pour le champ. Développement de réactifs lyophilisés (lyophilisé) qui ne nécessitent pas la chaîne du froid, avec une sensibilité au niveau des réactifs humide a amené les tests sur site distant à un but pratique.

Nous présentons ici une méthode pour le diagnostic rapide de l'AIV chez les oiseaux sauvages en utilisant une unité de RT-PCR (Ruggedized avancée des périphériques d'identification des agents pathogènes ou rapide, des technologies de l'Idaho, de Salt Lake City, UT) qui emploie des réactifs lyophilisés (grippe A Cible 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Technologies Idaho). Les réactifs contiennent tous les composants nécessaires pour les tests à des concentrations appropriées dans un seul tube: amorces, des sondes, des enzymes, les tampons et les contrôles internes positifs, éliminant les erreurs liées à un mauvais entreposage ou la manipulation de réactifs humide. L'unité portable effectue un écran pour la grippe A en ciblant le gène de la matrice et donne des résultats en 2-3 heures. Sous-typage génétique est également possible avec un apprêt H5 et H7 jeux qui ciblent le gène hémagglutinine.

Le système est adapté pour une utilisation sur des échantillons cloacaux et oropharyngée prélevés sur des oiseaux sauvages, comme l'a montré ici sur les espèces de limicoles migrateurs, le bécasseau d'Alaska (Calidrus mauri) capturé en Californie du Nord. La manipulation des animaux suivis protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation de l'US Geological Survey Western Centre de recherche écologique et permet de l'Oiseau US Geological Survey Banding Laboratory. Le principal avantage de cette technique est d'accélérer le diagnostic des oiseaux sauvages, ce qui augmente les chances de contenir une épidémie dans un endroit éloigné. Diagnostic sur site serait également s'avérer utile pour identifier et étudier les individus infectés dans les populations sauvages. La possibilité de collecter des informations sur la biologie hôte (réponse immunologique et physiologique à l'infection) et de l'écologie spatiale (performance migratoires des oiseaux infectés) fourniront un aperçu de la mesure dans laquelle les oiseaux sauvages peuvent agir comme des vecteurs de l'AIV sur de longues distances.

Protocol

1. Capture d'oiseaux sauvages au moyen de filets brouillard Pour la capture d'oiseaux de rivage, mis en place des filets de brume à un site actif butinage, comme un marais, le littoral, ou de la boue à plat. Glissez trémails ligne de boucles d'un bout du filet autour du pôle et insérez pole verticalement dans la boue. Étends net, insérez le deuxième pôle à travers les boucles trémails à l'autre extrémité du filet de brume et verticalement, insérez poteau dans…

Discussion

La méthode de diagnostic rapide facilite les tests présentés ici de temps précis et efficace des échantillons d'oiseaux sauvages pour la surveillance de l'AIV. Les exigences beaucoup moins strictes de stockage portables spécimen de RT-PCR sont adaptés à des situations isolées où le maintien d'une chaîne du froid peut être impraticable si les expéditeurs azote liquide ou de glace sèche n'est pas disponible. De plus, nous avons constaté que l'analyse de l'échantillon avec les réact…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier M. Scullion et R. Crisp des Technologies de l'Idaho pour le soutien technique et le Centre de recherche écologique USGS occidentaux pour le financement (S. Schwarzbach) et l'assistance (K. Spragens, T. Graham). Cette recherche a été réalisée sous les auspices du Centre pour la technologie innovatrice – Institut pour la Défense et la Sécurité intérieure (www.idhs.org), à l'appui du ministère de la Défense et Air Force Research Laboratory. La manipulation des animaux suivis protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation de l'US Geological Survey Western Centre de recherche écologique et permet de l'Oiseau US Geological Survey Banding Laboratory. Toute utilisation des appellations commerciales, des produits, ou de l'entreprise dans cette publication est à des fins descriptives et n'implique pas l'approbation par le gouvernement américain.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
RNeasy mini spin column Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Collection tubes (1.5 & 2 mL) Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RLT Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RW1 Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
Buffer RPE Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
RNase-free water Qiagen 74106 Included in RNeasy Mini Kit
14.3 M β-mercaptoethanol solution Fisher Scientific BP176100  
100% ethanol Fisher Scientific NC9602322  
Vortex Genie 2, 120V Scientific Industries SI-0236  
Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) Idaho Technologies ASAY-ASY-0109  
Lightcycler 20ml capillary tubes Roche Applied Science 04929292001  
Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Pentium-based laptop with Windows XP Professional Idaho Technologies   Included in RAPID kit
Lightcycler Data Analysis software Idaho Technologies   Included in RAPID kit

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Cite This Article
Takekawa, J. Y., Hill, N. J., Schultz, A. K., Iverson, S. A., Cardona, C. J., Boyce, W. M., Dudley, J. P. Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field. J. Vis. Exp. (54), e2829, doi:10.3791/2829 (2011).

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