Summary

Toxoplasma gondii Formação parede do cisto no Activated derivadas da medula óssea macrófagos e Condições Bradyzoite

Published: August 12, 2010
doi:

Summary

Toxoplasma gondii se converte em uma forma de cisto em resposta ao estresse ambiental, que pode ser imitada em modelos de cultura de tecidos. Este vídeo demonstra técnicas para examinar a formação de parede do cisto, ativando derivadas da medula óssea macrófagos ou alterar o pH de crescimento médio em células de fibroblastos.

Abstract

Toxoplasma gondii é um parasita intracelular obrigatório que pode invadir qualquer célula nucleada de animais de sangue quente. Durante a infecção, T. gondii dissemina como uma forma rápida replicação chamado tachyzoite. Taquizoítos converter em uma forma de crescimento lento encistados chamado bradyzoite por um processo de sinalização que não está bem caracterizada. Dentro de animais, cistos bradyzoite são encontradas no sistema nervoso central e tecido muscular e representam a fase crônica da infecção. Conversão para bradyzoites pode ser simulada em cultura de tecidos por inanição CO 2, utilizando meio com pH elevado, ou a adição de interferon gama (IFNγ). Bradyzoites são caracterizadas pela presença de uma parede do cisto, a que a lectina Dolichos biflorus aglutinina (DBA) liga. DBA fluorescente etiquetado é usado para visualizar a parede do cisto no parasitas cultivados em fibroblastos humanos prepúcio (HFFS) que tenham sido expostos a baixa emissão de CO 2 e pH médio alto. Da mesma forma, os parasitas que residem no óssea de camundongos derivadas da medula macrófagos (BMMs) exibir uma parede do cisto detectáveis ​​por DBA após o BMMs são ativados com IFNγ e lipopolissacarídeo (LPS). Este protocolo irá demonstrar como induzir a conversão de T. gondii para bradyzoites usando um meio de crescimento elevado pH, com baixa de CO 2 e ativação de BMMs. Células do hospedeiro serão cultivadas em lamínulas, infectados com taquizoítos e quer ativado com adição de IFNγ e LPS (BMMs) ou expostos a um meio de alto pH de crescimento (HFFS) por três dias. Após a conclusão de infecções, células hospedeiras será corrigido, permeabilizadas, e bloqueado. Paredes do cisto será visualizado utilizando rodamina DBA com microscopia de fluorescência.

Protocol

1. Preparação de fibroblastos humanos prepúcio (HFF) revestido lamínulas Coloque uma lamela de vidro estéril redonda sobre o fundo dos poços de uma placa de cultura de 24 poços de tecido. Para colher HFFS de um frasco de 150 centímetros confluentes 2, lavar o balão com duas 1X PBS e adicionar 2,5 ml de 0,025% de tripsina-EDTA. Incubar frasco a 37 ° C por 5-10 minutos. Tocando o lado do frasco contra a palma da sua mão pode ajudar em destacar as células do frasco. Uma…

Discussion

Embora o mecanismo de desenvolvimento bradyzoite não é totalmente compreendido, molecular análises genéticas de T. gondii estágio de conversão em cultura de tecidos tem levado à descoberta de genes que estão envolvidos na formação de cistos bradyzoite 2,3,4. As análises também levaram à observação de que alguns marcadores bradyzoite são expressas em outras condições de estresse prolongado, incluindo o crescimento em macrófagos ativados 5,6. Os métodos acima descrevem co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pela Universidade de Wisconsin-Madison Herman I. Shapiro Distinguished Graduados (CMT), NIH prêmio AI072817 (AMP) e American Heart Association Award 0840059N (LJK).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Bovine serum albumin   Sigma A7906  
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)   Gibco 11960-051  
Fetal Bovine Serum (FBS)   Atlanta Biologicals S11150 heat inactivate
Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin   Vector Laboratories RL-1032  
Formaldehyde (16%)   Polysciences 18814  
Glycine   Fisher Scientific BP381-5  
HEPES   Fisher Scientific BP310-1  
IFNγ   PeproTech 315-05 Store in single use aliquots
L-glutamine (200mM)   Gibco 25030  
Lipopolysaccharide (LPS)   Sigma L4391-1MG Store in single use aliquots
Microscope Cover Glass   Fisher Scientific 12-545-80 12CIR-1  
Penicillin-Streptomycin   Gibco 15140  
RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate)   Gibco 31800-022  
Triton-X-100   Fisher Scientific BP151-500  
Trypsin-EDTA (0.25%)   Gibco 25200  
VectaShield mounting media with DAPI   Vector Laboratories H-1200  

References

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Cite This Article
Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions. J. Vis. Exp. (42), e2091, doi:10.3791/2091 (2010).

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