Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB
Summary
Toxoplasma gondii verwandelt sich in eine Zyste bilden als Reaktion auf Belastungen der Umwelt, die in Gewebekultur-Modellen nachgeahmt werden kann. Dieses Video zeigt Techniken, um Zystenwand Bildung durch Aktivierung des Knochenmarks-Makrophagen oder Ändern Wachstumsmedium pH in Fibroblasten-Zellen zu untersuchen.
Abstract
Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazelluläre Parasiten, die jeder kernhaltigen Zelle des Warmblüter eindringen können. Während der Infektion, T. gondii verbreitet als schneller replizierende Form genannt tachyzoite. Tachyzoiten in eine langsam wachsende encystierten Form genannt bradyzoite durch eine Signalisierung, die nicht gut charakterisiert konvertieren. Innerhalb Tiere sind bradyzoite Zysten in das zentrale Nervensystem und Muskelgewebe und stellen die chronische Phase der Infektion. Die Umstellung auf Bradyzoiten können in Gewebekultur simuliert CO 2 Hunger, mit Medium mit hoher pH-Wert oder die Zugabe von Interferon-gamma (IFN &ggr;). Bradyzoiten werden durch die Anwesenheit einer Zystenwand, zu denen das Lektin Dolichos biflorus Agglutinin (DBA) bindet charakterisiert. Fluoreszenzmarkierten DBA wird die Zystenwand in Parasiten im menschlichen Vorhaut-Fibroblasten (HFFS), die zu niedrigen CO 2 und hoher pH-Milieu ausgesetzt waren, gewachsen zu visualisieren. Ebenso, wohnhaft Parasiten in murinen Knochenmark-Makrophagen (BMMS) zeigt eine Zystenwand nachweisbar durch DBA nach dem BMMS mit IFNy und Lipopolysaccharid (LPS) aktiviert werden. Dieses Protokoll wird zeigen, wie die Umwandlung von T. induzieren gondii zu Bradyzoiten mit einem hohen pH-Wachstumsmedium mit niedrigem CO 2 und die Aktivierung der BMMS. Wirtszellen wird auf Deckgläsern kultiviert werden, infiziert mit Tachyzoiten und entweder mit Zugabe von IFN &ggr; und LPS (BMMS) aktiviert oder die von einem hohen pH Wachstumsmedium (HFFS) für drei Tage. Nach Abschluss der Infektionen wird Wirtszellen fixiert, permeabilisiert werden, und blockiert. Cyst Wände werden visualisiert Rhodamin DBA mit Fluoreszenzmikroskopie.
Protocol
Discussion
Während der Mechanismus der bradyzoite Entwicklung ist noch nicht vollständig verstanden, molekulargenetische Analysen von T. gondii Bühne Umwandlung in Gewebekultur hat zur Entdeckung von Genen, die in bradyzoite Zystenbildung 2,3,4 beteiligt sind geführt. Die Analysen auch auf die Beobachtung, dass einige bradyzoite Marker in anderen längeren Stress-Bedingungen, einschließlich des Wachstums in aktivierten Makrophagen 5,6 ausgedrückt werden geführt. Die oben genannten Methoden bes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate | |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | ||
| Formaldehyde (16%) | Polysciences | 18814 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | ||
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | ||
| IFNγ | PeproTech | 315-05 | Store in single use aliquots | |
| L-glutamine (200mM) | Gibco | 25030 | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391-1MG | Store in single use aliquots | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | Gibco | 31800-022 | ||
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 | ||
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
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