Summary

活性骨髄由来マクロファージとBradyzoite条件におけるトキソプラズマのシスト壁形成

Published: August 12, 2010
doi:

Summary

トキソプラズマ原虫は、組織培養モデルで模倣することができる環境ストレスに応答して嚢胞フォームに変換します。このビデオでは、骨髄由来のマクロファージや線維芽細胞の変化、増殖培地のpHを活性化することにより、嚢胞壁の形成を調べるためのテクニックを示しています。

Abstract

トキソプラズマ原虫は、温血動物の任意の有核細胞に侵入することができる偏性細胞内寄生体である。感染中に、T.原虫は tachyzoiteと呼ばれる高速な複製形態として発信しています。タキゾイトはよく特徴付けされていないシグナル伝達過程でbradyzoiteと呼ばれる成長が遅い被嚢の形に変換する。動物の中で、bradyzoite嚢胞は中枢神経系と筋肉組織で発見し、感染症の慢性期を表しています。 bradyzoitesへの変換は、高pH、またはインターフェロンγ(IFNγ)の添加により培地を用いて、CO 2飢餓による組織培養でシミュレーションを行うことができます。 Bradyzoitesは、レクチンがDolichos biflorus凝集素(DBA)が結合する嚢胞の壁の存在によって特徴付けられる。蛍光標識されたDBAは、低CO 2と高pHの培地にさらされたヒト包皮線維芽細胞(HFFs)で成長させた寄生虫の嚢胞壁を可視化するために使用されます。 BMMsがIFNγとリポ多糖(LPS)で活性化された後、同様に、内に存在する寄生虫は、マウス骨髄由来マクロファージ(BMMs)は、DBAによって検出可能な嚢胞壁が表示されます。このプロトコルは、Tの変換を誘導する方法を紹介します低CO 2とBMMsの活性化と高pHの増殖培地を使用してbradyzoitesに原虫 。宿主細胞は、カバースリップ上で培養タキゾイトに感染し、どちらかのIFNγとLPS(BMMs)の添加により活性化または三日間高pHの増殖培地(HFFs)に公開されます。感染症が完了すると、宿主細胞は、固定透過性、およびブロックされます。嚢胞壁は、蛍光顕微鏡とローダミンのDBAを使用して視覚化されます。

Protocol

1。ヒト包皮線維芽細胞(HFF)でコーティングされたカバースリップの準備 24ウェル組織培養プレートのウェルの底に滅菌円形のガラスのカバースリップを配置。 コンフルエント150センチメートル2フラスコからHFFsを回収するために、1 × PBSで2回フラスコを洗い、0.025%トリプシン- EDTA 2.5 mlを加える。 ℃で5〜10分間37℃でフラスコをインキュベートする。 手のひ?…

Discussion

T.のbradyzoiteの発展のメカニズムは完全には理解されていませんが、分子遺伝学的解析組織培養における原虫のステージの変換には、bradyzoite嚢胞形成2,3,4に関与する遺伝子の発見につながっている。分析はまた、いくつかのbradyzoiteマーカーは活性化マクロファージ5,6の成長を含む他の長引くストレス状態で発現されるという観察につながった。上記の方法では

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、ウィスコンシン大学マディソンハーマンI.シャピロ識別大学院フェローシップ(CMT)、NIHの賞AI072817(AMP)とアメリカ心臓協会賞0840059N(LJK)の大学によってサポートされていました。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Bovine serum albumin   Sigma A7906  
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)   Gibco 11960-051  
Fetal Bovine Serum (FBS)   Atlanta Biologicals S11150 heat inactivate
Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin   Vector Laboratories RL-1032  
Formaldehyde (16%)   Polysciences 18814  
Glycine   Fisher Scientific BP381-5  
HEPES   Fisher Scientific BP310-1  
IFNγ   PeproTech 315-05 Store in single use aliquots
L-glutamine (200mM)   Gibco 25030  
Lipopolysaccharide (LPS)   Sigma L4391-1MG Store in single use aliquots
Microscope Cover Glass   Fisher Scientific 12-545-80 12CIR-1  
Penicillin-Streptomycin   Gibco 15140  
RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate)   Gibco 31800-022  
Triton-X-100   Fisher Scientific BP151-500  
Trypsin-EDTA (0.25%)   Gibco 25200  
VectaShield mounting media with DAPI   Vector Laboratories H-1200  

References

  1. Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
  2. Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
  3. Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
  4. J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
  5. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
  6. Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
  7. Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W. Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion. Trends in Parasitology. 18 (5), 198-201 (2002).
  8. Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
  9. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
  10. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).

Play Video

Cite This Article
Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions. J. Vis. Exp. (42), e2091, doi:10.3791/2091 (2010).

View Video