Summary

Toxoplasma gondii Formation paroi du kyste dans la moelle osseuse Activé macrophages dérivés et Conditions Bradyzoite

Published: August 12, 2010
doi:

Summary

Toxoplasma gondii se convertit en une forme un kyste, en réponse aux stress environnementaux, ce qui peut être imité dans les modèles de culture de tissus. Cette vidéo montre des techniques pour examiner la formation des parois du kyste en activant la moelle osseuse dérivées des macrophages ou des changements de pH moyen de croissance des cellules de fibroblastes.

Abstract

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire qui peut envahir toute cellule nucléée des animaux à sang chaud. Lors de l'infection, T. gondii diffuse comme une forme rapide répliquant appelé tachyzoïtes. Tachyzoïtes convertir en une forme à croissance lente enkystées appelé bradyzoite par un processus de signalisation qui ne sont pas bien caractérisés. Dans les animaux, les kystes bradyzoite sont trouvés dans le système nerveux central et les tissus musculaires et représentent la phase chronique de l'infection. Conversion à bradyzoïtes peut être simulé en culture de tissus par le CO 2 la famine, l'aide moyenne avec un pH élevé, ou l'ajout d'interféron gamma (IFN). Bradyzoïtes sont caractérisées par la présence d'un kyste, à laquelle la lectine de Dolichos biflorus agglutinine (DBA) lie. DBA marqué par fluorescence est utilisée pour visualiser la paroi du kyste chez des parasites cultivés dans des fibroblastes de prépuce humain (HFFS) qui ont été exposés à faibles émissions de CO 2 et moyennes pH élevé. De même, les parasites qui résident dans les os murins dérivés de la moelle macrophages (BMMs) affichent une paroi du kyste détectable par DBA après la BMMs sont activés avec IFN et de lipopolysaccharides (LPS). Ce protocole va montrer comment induire une conversion de T. gondii à l'aide d'un support bradyzoïtes pH élevé de croissance avec le CO 2 à faible et l'activation de BMMs. Les cellules hôtes seront cultivés sur des lamelles, infectés par tachyzoïtes et soit activé avec plus d'IFNy et LPS (BMMs) ou exposé à un milieu de croissance à pH élevé (HFFS) pendant trois jours. À la fin des infections, des cellules hôtes seront fixées, perméabilisées, et bloqués. Parois des kystes seront visualisés en utilisant la rhodamine DBA avec la microscopie à fluorescence.

Protocol

1. Préparation de fibroblastes de prépuce humain (HFF) enduit de lamelles Placer une lamelle de verre stérile ronde sur le fond des puits d'une plaque de 24 puits de culture de tissu. Pour récolter HFFS d'une confluence 150cm 2 flacon, rincer le ballon deux fois avec du PBS 1X et ajouter 2,5 ml de 0,025% de trypsine-EDTA. Incuber flacon à 37 ° C pendant 5-10 minutes. Exploiter le côté du ballon de contre la paume de votre main peut aider à détacher les cellules…

Discussion

Bien que le mécanisme de développement bradyzoite n'est pas entièrement comprise, des analyses génétiques moléculaires de T. conversion de l'étape gondii dans la culture de tissus a conduit à la découverte des gènes qui sont impliqués dans la formation de kystes bradyzoite 2,3,4. Les analyses ont également conduit à l'observation que certains marqueurs bradyzoite sont exprimés dans d'autres conditions de stress prolongé, y compris la croissance dans les macroph…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l'Université du Wisconsin-Madison Herman I. Shapiro Distinguished Graduate Fellowship (CMT), l'attribution des NIH AI072817 (AMP) et l'American Heart Association Award 0840059N (LJK).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Bovine serum albumin   Sigma A7906  
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)   Gibco 11960-051  
Fetal Bovine Serum (FBS)   Atlanta Biologicals S11150 heat inactivate
Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin   Vector Laboratories RL-1032  
Formaldehyde (16%)   Polysciences 18814  
Glycine   Fisher Scientific BP381-5  
HEPES   Fisher Scientific BP310-1  
IFNγ   PeproTech 315-05 Store in single use aliquots
L-glutamine (200mM)   Gibco 25030  
Lipopolysaccharide (LPS)   Sigma L4391-1MG Store in single use aliquots
Microscope Cover Glass   Fisher Scientific 12-545-80 12CIR-1  
Penicillin-Streptomycin   Gibco 15140  
RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate)   Gibco 31800-022  
Triton-X-100   Fisher Scientific BP151-500  
Trypsin-EDTA (0.25%)   Gibco 25200  
VectaShield mounting media with DAPI   Vector Laboratories H-1200  

References

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Cite This Article
Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions. J. Vis. Exp. (42), e2091, doi:10.3791/2091 (2010).

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