1 일 : F. tularensis 플레이트 접종 F.의 플레이트 냉동 재고 문화 뮬러 – 힌턴 한천에 tularensis 2.5 % (권 / 권) 기증자 송아지 혈청, 2 % (권 / 권) IsoVitaleX, 0.1 % (WT / 권) 포도당, 그리고 0.025 % (WT / 권) 철 나트륨과 보충. F. 그로 ° C 5 % CO 2와 함께 약 24 H. 위해 37 tularensis 일 2 : F. tularensis 액체 미디어 접종 양이온 – 조정 뮬러 – 힌턴 매체 (1.23 MM의 염화칼슘 이수화물 및 1.03 MM의 마그네슘 염화 hexahydrate을 포함) 1 리터 준비하고 압력솥. 37 냉각하면 ° C, 0.1 % (WT / 권) 포도당, 0.025 % (WT / 권) 철 나트륨, 2 % (권 / 권) IsoVitaleX 대한 추가 보완 매체. 이 500 ML의 aliquots로 (0.22 μ) 소독 매체를 필터링합니다. 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 보충 뮬러 – 힌턴 매체 및 전송 12 ML를 제거합니다. 멸균 10 μl 접종 루프를 사용하여, F.의 큰 loopful을 다쳤어요 뮬러 – 힌턴 중간 (단계 2 참조) 12 ML에 한천 플레이트 (1 일 이상) 및 전송 박테리아에서 tularensis 성장. 피펫 솔루션을 여러 번 대단히 짧은 시간을 헤어지게하고 동질적인 박테리아 정지를 준비합니다. 와동하지 마십시오. 멸균 피펫을 사용하여 3 단계에서 세균 현탁액의 5 ML 각 500 ML 선박의 예방. 37 국물 문화를 성장 ° C 부드러운 흔들림 (뉴 브 런 즈윅 이노바 2300 시리즈 쉐이크에 190-200 RPM)를 14-18 H하십시오. 3 일 : Spheroplasting, 삼투 용해 및 자당 농도 구배 원심 분리 F.를 구합니다 tularensis의 흔들림이 인큐베이터에서 문화는 각각의 광학 밀도를 확인 각 500 ML 문화 1 – ML 나누어지는를 제거합니다. F.를 사용할 때 우리는 최적의 멤브레인 추출 및 절연 결과를 발견 0.2 사이 0.4 (~ 10월 7일에서 10월 8일까지 CFU / ML)로 OD 600과 상호 성장의 초기 단계에 로그 tularensis 세포. 0.2 이상의 OD 600 적은 비용으로 문화는 이후 자당의 그라디언트에 대한 총 멤브레인 소재의 충분한 수량을 얻을 수 없습니다. 반대로, 0.4 (고정 단계를 근접)보다 OD 600 이상과 문화가 혼합 막 fusions를 얻을 것으로되었습니다. 15 30 분 7,500 X g에서 문화를 원심 분리기 ° C는 세포를 수집합니다. 그것이 이후 펠렛 서스펜션을 용이하게하기 때문에 우리는, 넷 250 ML의 원심 분리기 병의 문화의 원심 분리하는 것이 좋습니다. 조심스럽게 각 원심 분리기 병에서 미디어 표면에 뜨는를 제거하고 단단히 초과 성장 매체를 제거하는 흡착제에 병을 누릅니다. 원심 분리의 10 분 이내에 다음과 같은 완성, 0.75 M의 자당 (5 MM 트리스, 산도 7.5의)의 8.75 ML 각 박테리아 펠렛을 일시 중지합니다. 이들 네 박테리아 쥐똥이 일시 중지하고 10 분 이내에 살균 250 ML 플라스크 (작은 stirbar로)로 (세균성 정지 35 ML 총) 양도해야합니다. 부드럽게 stirplate에 세포 현탁액을 혼합하는 동안, 천천히 10 분 과정 10여 MM 나트륨 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 70 ML (2 볼륨) (5 MM 트리스, 산도 7.8)을 추가합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 높은 지방 농도를 피하기 위해 세포 현탁액 수준 아래 피펫의 끝에있는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가합니다. stirbar 철저하게 얼굴이 볼만 또는 버블 형성 원인만큼 빠른 세포 현탁액을 혼합 아니라 충분한 속도로 회전해야합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션이 추가되었습니다 후, 실온에서 30 분 솔루션을 품어. 30 분 부화 후, 천천히 200 μg / ML의 최종 농도 2 MG / ML 라이 소 자임 솔루션 11 ML (1 / 10 일 볼륨)을 추가합니다. 라이 소 자임 솔루션뿐만 동안 세포 현탁액을 섞어 계속합니다. 위에서 바와 같이, 라이 소 자임의 높은 지방 농도를 피하기 위해 세포 현탁액 유체 수준 아래에 피펫 팁과 라이 소 자임 솔루션을 추가합니다. 주식 라이 소 자임 솔루션 (2 MG / ML) 단일 사용 aliquots에서 준비하고 3~4개월위한 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 실온에서 30 분 결과 솔루션을 품어. 30 분 동안 부화, 작은 stirbar 룸 온도 Cellgro 분자 학년 DH 2 O (4.5 권)의 530 ML과 멸균 1L 플라스크를 준비합니다. Osmotically 부드러운 혼합과 10-15 분 과정을 통해 분자 학년 DH 2 O (7 단계에서)의 530 ML에 느린 희석 (약 11 ML / 분 유량)의 세포 현탁액을 (6 단계에서) lyse. 때문에이 단계에서 큰 솔루션 볼륨의 적절한 혼합을 보장하기 위해 stirbar 속도를 향상시킬 수 있습니다. stirbar 얼굴이 볼만 또는 버블 형성으로 이어질 정도로 빠르게하지 철저하게 세포 현탁액을 분산하기 위해 충분한 한번 DH 2 O에 추가 속도로 회전하지만해야합니다. 셀의 균일한 희석을 촉진하기 위하여, 피펫의 끝은 stirbar에 인접한 술병의 바닥에 휴식과 세포 현탁액을 추가내 현탁액. 우리는 25 – ML의 pipettes이 단계에서 가장 잘 작동 것으로 나타났습니다. 조심스럽게 희석 과정을 모니터하고 유속 세포, 세포 대단히 짧은 시간, 그리고 세포 가닥의 로컬 쌓일 해산하기 위해 필요를 방해. 실온에서 30 분 결과 솔루션을 품어. 이 단계가 가장 도전적이고 실험의 전반적인 성공에 중요한 중 하나 나타납니다. 30 분 부화 후 10시 30 분 7500 XG 50 – ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 삼투 용해 용액 40 ML aliquots를 전송 ° C가 그대로 세포와 이물질을 제거합니다. 원심 분리 후, 조심스럽게 멸균 1L 플라스크에 각 원뿔 관 및 수영장 supernatants에서 뜨는의 27-30 ML을 제거 4 2 H에 대한 200,000 X G (F50L – 8×39 FiberLite의 초원 심 분리기의 회전자에 44,400 RPM) ° C. 16 초원 심 분리기 튜브와 원심 분리기로, 각각 풀링 뜨는 25 ML을 전송 각 로터 8 튜브를 보유하고 있습니다,이 단계 두 로터 두 ultracentrifuges 필요하므로. 또한, 8 튜브의 두 번째 세트 centrifuged ° C까지 4에서 개최한다. 초원 심 분리기 실행의 완성 10 분 이내에 멤브레인 resuspension 버퍼를 수정할 준비를합니다. 멸균 튜브에 막 중지 버퍼 8 ML (25 % [WT / WT] 자당, 5 MM 트리스, 30 MM MgCl 2) 전송 및 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – 무료 테아제 억제제 칵테일과 Benzonase의 375 U 1 타블렛을 추가합니다. 부드럽게 테아제 억제제의 정제를 해산하기 위해 솔루션을 섞는다. ultracentrifugation에 따라 신중하게, supernatants를 부어 흡착제에 초원 심 분리기 튜브를 반전하고, 단단히 초과 뜨는을 제거하기 위해 튜브를 누릅니다. 시각화에 도움을 마커 각 막 펠렛의 위치를 표시합니다. 부드럽게 600 μl 수정 막 resuspension 버퍼의 각의 8 멤브레인 알약을 resuspend. 부드럽게 멸균 튜브에이 여덟 산탄, 그리고 수영장 결과 멤브레인 resuspensions을 resuspend 여덟 튜브의 다음 세트 각 막 resuspension을 전송합니다. 그것이 멀리 튜브의 벽에서 필스 때까지 pelleted 점막이 resuspend하기 어려운되므로, 펠렛을 통해 수정된 막 resuspension 버퍼를 통과 계속합니다. 그것은 종종 resuspension 과정에서 튜브 벽 및 원조에서 멤브레인 펠렛를 긁어 micropipette 팁을 사용해야합니다. pipetting 때, 얼굴이 볼만 피하거나 거품이 형성. 이 단계가 가장 도전적이고 실험의 전반적인 성공에 중요한 중 하나 나타납니다. 멤브레인 알약이 resuspended 모든 16 튜브에서 제거된 경우, 수정된 멤브레인 resuspension 버퍼 600 μl와 매 4 튜브를 씻으십시오. 세척은 각 튜브의 표시 영역 (막 펠렛) 주변에 집중해야합니다. 막 resuspension 튜브로 세척을 전송합니다. 네 튜브의 나머지 세 세트를위한 세척 단계를 반복합니다. 응집 물질의 감소에 DNA와 도움을 손상시키고 실온에서 30 분 부드러운 락을 함께 막 resuspension을 품어. 막 현탁액의 작은 나누어지는을 제거하고 전체 멤브레인 수율을 결정하는 단백질 부량을 수행합니다. 우리는 일반적으로 undiluted 준비, 1:1 (2.5 % SDS)을 희석하고, 1시 3분 90시 (2.5 % SDS)를 막 샘플, 열 샘플을 희석 ° 10 분, 그리고 수치 BioRad DC의 단백질 분석을 사용하기 위해 C 막 resuspension 단백질 농도. 총 단백질 수율 1.0 MG / ML 1.6 MG / ML 사이에 일반적으로있다. 열과 SDS의 사용은보다 정확한 단백질 부량 값을 얻을 수 있도록 압축이 풀린 세포막에서 OMPs을 해제해야합니다. 55%, 50 %, 45 %, 다음 순서대로 14 X 95mm 울트라 클리어 초원 심 분리기 튜브로 겹겹이 1.8 ML 자당 솔루션의 각 (WT / WT, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.5의 준비)에 의해 선형 자당의 그라디언트 준비 40 %, 35%, 30 %. 자당의 그라디언트의 겹겹이는 전구의 pipettor 아니라 자동 pipettor를 사용할 때 수행하는 가장 쉬운 방법입니다. 막 resuspension 단백질 양을 정함 (단계 16), 레이어의 각 그라디언트 위에 막 resuspension 1.5 MG에 따라. 각 14 X 95mm의 초원 심 분리기 튜브는 10.8 ML은 단계 17에서 자당 솔루션에 의해 차지하는 것을 주어진 최대 12.5 ML의 용량과를 가지고, 당신은 그라디언트마다 막 resuspension 이상의 1.7 ML를 로드할 수 없습니다. 모든 튜브는 (± 0.01 g) 같은 무게 때문에 각 자당 기울기 관의 마지막 무게를 (막 resuspension를 추가하거나 제거하여) 개별적으로 무게와 신중하게 조정합니다. 4 17 H 최소 256,000 X G (38,000 RPM) ° C.에서 SW – 40Ti 스윙 버킷 로터와 원심 분리기에 자당의 그라디언트를 전송 주 4 : 자당 기울기 분수 수집 원심 분리 17 H 후, 원심 실행을 중지하고, 조심스럽게 SW – 40Ti의 회전자에서 자당의 그라디언트를 제거합니다. 70 % 에탄올로 자당 기울기 튜브의 아래쪽, 바늘을 조심스럽게 청소21g 바늘로 튜브의 아래쪽, 그리고 무균 microfuge 튜브에 그라디언트에서 순차 500 μl 분수를 수집합니다. 이후 그라디언트에 대한 반복합니다. 기울기가 중력의 흐름에 의해 똑 수 있어야하므로 같은 자당 기울기를 방해하지 않습니다. 흘리지는 그라디언트 튜브의 바닥에서 멈추면 경우, 압력 소량 하나의 손가락을 사용하여 튜브의 상단에 적용할 수 있습니다. 굴절계를 사용하여 각 자당 기울기 분율의 굴절률을 결정하고 G / ML 1 특정 밀도 굴절률을 상관 관계. nitrocellulose로 전송, SDS – PAGE 분리, 그리고 immunoblotting, 대표 자당 기울기 분수 (1.11에서 G / ML 1.26 G / ML에 0.01의 밀도 증가)을 준비하여 단백질 지방화을 평가합니다. 대표 결과 두 종류의 메신저와 OM의 vesicles의 완전한 분리에 제대로 수행이 절차 결과 (예 : SchuS4)과 B 타입의 F. (예 : LVS) 종자 tularensis. 그림 1, F. 대표 immunoblots에 표시 tularensis의 OMPs는 1.17 및 1.20 g / ML의 밀도 사이에 집중. 비교함으로써, IMPs는 1.13 및 1.14 g / ML의 밀도 사이에 집중. 그림 1. F.의 Immunoblotting tularensis의 자당 밀도 기울기. 연속 분수는 그라디언트와 밀도 (g / ML) 굴절 지수에 기초하여 계산되었다에서 수집되었다. 단백질은 SDS – PAGE로 구분하여 nitrocellulose로 전송하고, OMP 그리고 IMP 분별 (분리)을 감지 immunoblotted했다. MW는 크기 (KDA)를 각 얼룩의 왼쪽에있는 언급과 분자량 표준을 prestained. F.의 LVS, 전체 세포 lysates tularensis의 LVS. 해당 자당 기울기 분율의 밀도는 각각의 차선 위에 설명되어 있습니다. 로 왼쪽 여백에 명시된 바와 같이 OMPs와 IMPs는, polyclonal, monospecific antisera과 함께 발견되었다. 비슷한 결과는 F.에 대한 취득했다 tularensis SchuS4.