Giorno 1: F. tularensis piastra inoculazione Piastra colture base congelate di F. tularensis su Mueller-Hinton agar integrato con il 2,5% (vol / vol) donatore nel siero di vitello, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (peso / volume) di glucosio, e 0,025% (peso / volume) pirofosfato di ferro. Crescere F. tularensis a 37 ° C con 5% di CO 2 per circa 24 h. Giorno 2: F. tularensis inoculazione liquido dei media Preparare e autoclave 1 litro di cationi regolato Mueller-Hinton medio (1,23 contenente cloruro di calcio diidrato mM e 1,03 mM cloruro di magnesio esaidrato). Quando sono raffreddati a 37 ° C, media ulteriore supplemento con 0,1% (peso / volume) di glucosio, pirofosfato di ferro 0,025% (peso / volume), e il 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filtro sterilizzare (0,22 μ) di media in due aliquote da 500 ml. 12 ml di rimuovere integrato Mueller-Hinton media e il trasferimento in una sterile da 50 ml tubo Falcon. Usando una sterile 10 microlitri ansa da inoculo, raschiare un'ansata grande di F. crescita tularensis da piastre di agar (dal giorno 1) e batteri trasferimento in 12 ml di Mueller-Hinton medio (vedi punto 2). Volte la soluzione più pipetta di break-up grumi e preparare omogenea sospensione batterica. Non vortice. Utilizzando una pipetta sterile, inoculare ciascuna da 500 ml vaso con 5 ml di sospensione batterica dal punto 3. Grow culture brodo a 37 ° C per 14 a 18 h agitando delicatamente (190-200 giri al minuto su un Brunswick New Innova serie 2300 shaker). 3 ° giorno: Spheroplasting, la lisi osmotica, e la densità centrifugazione gradiente di saccarosio Ottenere F. culture tularensis dal agitazione incubatore e rimuovere una da 1 ml aliquota da ogni 500 ml di cultura per verificare la densità rispettive ottiche. Abbiamo trovato l'estrazione ottimale della membrana e dei risultati quando si usa l'isolamento F. cellule tularensis all'inizio fase logaritmica di crescita, che si correla con un diametro esterno 600 tra 0,2 e 0,4 (~ 10 LUGLIO – 10 AGOSTO UFC / ml). Culture, con un diametro esterno 600 inferiore a 0,2 non produrrà quantità sufficiente di materiali membrana totale per le sfumature saccarosio successive. Al contrario, le culture con un diametro esterno 600 superiore a 0,4 (in via di fase stazionaria) sono stati trovati per produrre misto membrana fusioni. Centrifugare culture a 7.500 x g per 30 minuti a 15 ° C per raccogliere le cellule. Si consiglia di centrifugazione di culture in quattro bottiglie da 250 ml centrifuga, perché facilita successiva sospensione a pellet. Rimuovere con attenzione il sopranatante media da ogni bottiglia centrifuga e picchiettare le bottiglie in materiale assorbente per eliminare l'eccesso di crescita medio. Entro 10 minuti dopo il completamento della centrifugazione, ogni sospensione batterica pellet in 8,75 ml di saccarosio 0,75 M (in 5 mM Tris, pH 7,5). Tutti e quattro i pellet batterico deve essere sospeso e trasferito (35 totale ml di sospensione batterica) ad una sterile pallone da 250 ml (con un piccolo stirbar) entro 10 minuti. Mentre dolcemente mescolando la sospensione cellulare su un stirplate, aggiungere lentamente 70 ml (2 volumi) di 10 mm disodico EDTA (in 5 mM Tris, pH 7.8) nel corso di 10 min. Aggiungere la soluzione di EDTA con la punta della pipetta di sotto del livello di sospensione cellulare al fine di evitare elevate concentrazioni locali di EDTA. Il stirbar dovrebbe essere a rotazione ad una velocità sufficiente per mescolare completamente la sospensione cellulare, ma non abbastanza veloce da provocare la formazione di schiuma o bolle. Dopo la soluzione di EDTA è stato aggiunto, incubare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione 30 minuti, aggiungere lentamente 11 ml (° 1 / 10 del volume) di un mg / ml 2 soluzione di lisozima alla concentrazione finale di 200 mg / ml. Continuare a mescolare la sospensione cellulare durante l'aggiunta soluzione di lisozima. Come notato sopra, aggiungere la soluzione di lisozima con la punta della pipetta di sotto del livello del liquido cellulare sospensione per evitare elevate concentrazioni locali di lisozima. Soluzioni madre lisozima (2 mg / ml) possono essere preparati in monouso aliquote e conservati a -20 ° C per 3-4 mesi. Incubare la soluzione così ottenuta per 30 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione 30 minuti, preparare un pallone sterile 1L con un piccolo stirbar e 530 ml di temperatura ambiente Cellgro Molecolare Grado dH 2 O (4,5 volumi). Osmoticamente lisare la sospensione cellulare (a partire dal punto 6) per diluizione lenta (velocità di flusso di circa 11 ml / min) in 530 ml di dH Molecolare Grado 2 O (dal punto 7) nel corso di 10 a 15 minuti con miscelazione delicata. A causa del volume della soluzione più grandi in questa fase, aumentare la velocità stirbar per garantire la corretta miscelazione. Il stirbar dovrebbe essere a rotazione ad una velocità sufficiente a disperdere completamente la sospensione cellulare, una volta aggiunti ai 2 dH O, ma non abbastanza veloce per portare alla formazione di schiuma o bolle. Aggiungere la sospensione cellulare con la punta della pipetta appoggiato sul fondo del pallone, adiacente al stirbar, per facilitare la diluizione uniforme del cell sospensione. Abbiamo scoperto che da 25 ml pipette funzionano meglio durante questa fase. Monitorare attentamente il processo di diluizione e interrompere il flusso, se necessario, per disperdere gli accumuli locali di cellule, ammassi di cellule, e ciuffi cellulare. Incubare la soluzione così ottenuta per 30 minuti a temperatura ambiente. Si noti che questo passo sembra essere una delle più difficili e critici per il successo globale di questo esperimento. Dopo l'incubazione 30 minuti, trasferire 40 ml di soluzione di lisi osmotica in tubi conici da 50 ml e centrifugare a 7500 xg per 30 minuti a 10 ° C per rimuovere le cellule intatte e detriti. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela 27-30 ml di surnatante da ogni tubo conico e surnatanti piscina in un recipiente sterile 1L Trasferire 25 ml di surnatante in pool, ciascuna, in 16 tubi ultracentrifuga e centrifugare a 200.000 g (44.400 rpm in F50L-8×39 rotore Fiberlite ultracentrifuga) per 2 ore a 4 ° C. Si noti che ogni rotore contiene 8 tubi, così questo passo richiede due rotori e due ultracentrifughe. In alternativa, la seconda serie di 8 tubi dovrebbero essere tenute a 4 ° C fino centrifugato. Entro 10 minuti della fine del percorso ultracentrifuga, preparare modificato risospensione del buffer membrana. Trasferimento 8 ml di tampone membrana sospensione (25% [wt / wt] saccarosio, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) in una provetta sterile e aggiungere 1 compressa di EDTA-free cocktail inibitori della proteasi e 375 U di benzonasi. Mescolare delicatamente la soluzione per sciogliere inibitore della proteasi compressa. A seguito di ultracentrifugazione, accuratamente versare off surnatanti, invertire i tubi ultracentrifuga su materiale assorbente e picchiettare tubi per rimuovere il surnatante in eccesso. Segnare la posizione di ciascun pellet membrana con un pennarello per aiutare nella visualizzazione. Risospendere delicatamente otto pellet membrana con 600 microlitri di tampone ogni membrana modificata risospensione. Trasferimento di ogni risospensione membrana per la prossima serie di otto tubi, risospendere delicatamente questi otto pellet, e la piscina resuspensions membrana risultante in un tubo sterile. Le membrane di pellet sono difficili da riportare in sospensione, in modo da continuare a passare la modifica tampone risospensione membrana sopra il pellet fino a quando non si stacca dalla parete del tubo. Spesso è necessario utilizzare la punta micropipetta per raschiare il pellet membrana al largo della parete del tubo e gli aiuti nel processo di risospensione. Quando pipettaggio, evitare la formazione di schiuma o formazione di bolle. Si noti che questo passo sembra essere una delle più difficili e critici per il successo globale di questo esperimento. Quando la membrana pellet sono stati risospesi e rimosso da tutti i 16 tubi, lavare ogni quattro tubi con 600 ml di buffer di membrana modificata risospensione. Il lavaggio dovrebbe essere focalizzata intorno alla zona segnata (membrana pellet) di ciascun tubo. Trasferire il lavaggio nel tubo risospensione membrana. Ripetere la fase di lavaggio per i restanti tre serie di quattro tubi. Incubare la risospensione membrana con dondolo dolce per 30 minuti a temperatura ambiente per degradare il DNA e l'aiuto nella riduzione del materiale flocculante. Rimuovere una piccola aliquota della sospensione membrana ed eseguire la quantificazione di proteine per determinare la resa totale della membrana. Noi di solito preparare non diluito, diluito 1:1 (nel 2,5% SDS), e 1:3 diluito (nel 2,5% SDS) i campioni di membrana, i campioni di calore a 90 ° C per 10 minuti, e utilizzare il BioRad DC Protein Assay per quantificare la membrana risospensione concentrazione proteica. Resa di proteine totali è generalmente compreso tra 1,0 mg / ml e 1,6 mg / ml. L'utilizzo di calore e di SDS sono tenuti a rilasciare OMP dalle membrane estratte in modo che una più accurata quantificazione del valore proteico può essere ottenuto. Preparare gradienti di saccarosio lineare stratificazione 1,8 ml ognuna delle soluzioni di saccarosio (peso / peso, preparata in 5 mM EDTA, pH 7,5) in 14 x 95 mm Ultra-Clear tubi ultracentrifuga nel seguente ordine: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Stratificazione di gradienti di saccarosio è più facile da eseguire quando si utilizza una pipetta a bulbo, non un pipettatore automatico. Basato sulla quantificazione delle proteine di membrana risospensione (Step 16), strato di 1,5 mg di risospensione membrana in cima ad ogni pendenza. Ogni x 14 95 tubo ultracentrifuga mm ha una capacità massima di 12,5 ml e, visto che 10,8 ml è rappresentata dalle soluzioni di saccarosio a partire dal punto 17, non si deve caricare più di 1,7 ml di risospensione membrana per gradiente. Peso individuale e regolare con cura il peso finale di ogni tubo gradiente di saccarosio (aggiungendo o rimuovendo risospensione membrana) in modo che tutti i tubi pesano uguali (± 0,01 g). Trasferimento gradienti di saccarosio in una SW-40Ti rotore oscillante e centrifugare a 256.000 x g (38.000 rpm) per un minimo di 17 ore a 4 ° C. Giorno 4: Raccolta delle frazioni gradiente di saccarosio Dopo 17 h di centrifugazione, fermare la corsa centrifuga, e rimuovere attentamente gradienti di saccarosio dalla SW-40Ti rotore. Pulire accuratamente la parte inferiore del tubo gradiente di saccarosio con il 70% di etanolo, la punturafondo della provetta con un ago 21G, e raccogliere frazioni sequenziale 500 microlitri dal gradiente in provette sterili microcentrifuga. Ripetere l'operazione per gradienti successive. Il gradiente dovrebbe essere consentito a gocciolare dal flusso di gravità, in modo da non disturbare il gradiente di saccarosio. Tuttavia, se il gocciolamento cessa dalla parte inferiore del tubo di pendenza, una piccola quantità di pressione può essere applicato alla parte superiore del tubo usando un dito. Determinare l'indice di rifrazione di ogni frazione gradiente di saccarosio utilizzando un rifrattometro e correlare l'indice di rifrazione con una densità specifica in g / ml 1. Valutare la localizzazione delle proteine con la preparazione rappresentante frazioni gradiente di saccarosio (incrementi di densità di 0,01, da 1,11 g / ml a 1,26 g / ml) per SDS-PAGE la separazione, il trasferimento di nitrocellulosa, e immunoblotting. Rappresentante Risultati Quando eseguito correttamente, questa procedura comporta la completa separazione di IM e vescicole OM sia da Tipo A (ad esempio SchuS4) e di tipo B (per esempio LVS) ceppi di F. tularensis. Come mostrato in immunoblot rappresentante nella Figura 1, F. OMP tularensis localizzare tra densità di 1,17 e 1,20 g / ml. In confronto, PIM localizzare tra densità di 1,13 e 1,14 g / ml. Figura 1. Immunoblotting di F. tularensis gradienti di densità di saccarosio. Frazioni sequenziali sono stati raccolti da sfumature e densità (g / ml) sono stati calcolati sulla base degli indici di rifrazione. Le proteine sono state separate mediante SDS-PAGE, trasferite su nitrocellulosa, e immunoblotted per rilevare OMP e frazionamento IMP. mw, prestained standard di peso molecolare con dimensioni (in kDa) ha notato sul lato sinistro di ogni macchia. LVS, lisati di cellule intera F. tularensis LVS. La densità di saccarosio corrispondente frazione del gradiente sono notati sopra le loro rispettive corsie. OMP e PIM, come indicato sul margine sinistro, sono stati rilevati con policlonali, antisieri monospecifici. Risultati simili sono stati ottenuti per F. tularensis SchuS4.