内层和外层膜分离议定书<em>弗朗西斯tularensis</em> spheroplasting,渗透溶解,和蔗糖密度梯度离心。
弗朗西斯tularensis是一种革兰氏阴性细胞内coccobacillus和人畜共患病兔热病的病原体。当与其他细菌病原体的感染剂量极低(<10 CFU),疾病进展迅速,高发病率和死亡率表明, 弗朗西斯的毒株为新的致病因素的编码相比。暴露于表面的分子,即外膜蛋白(OMPS),已被证明是促进细菌宿主细胞结合,条目,细胞内生存,毒力和免疫逃避。进一步强调的事实,他们可以作为对一些细菌性疾病的保护疫苗研究外膜蛋白的相关性。鉴于可以从革兰氏阴性菌中提取的,通过批量膜萃取技术,包括超声离心和/或洗涤剂提取细胞的外膜蛋白,这些准备工作往往与周质和/或细胞质(内)膜(IM)污染物污染。多年来,为革兰氏阴性IM和外膜的生化和生物物理分离方法的“金标准”(OM),已受细菌spheroplasting和渗透裂解,蔗糖密度梯度离心。一旦蔗糖梯度层,OMS可以从IMS分离的基础上浮力密度的差异,被认为在很大程度上存在在OM脂多糖(LPS)的前提。在这里,我们描述了一个严谨和优化的方法来提取,丰富和隔离楼tularensis外膜和其相关的外膜蛋白。
这个协议描述一个spheroplasting,渗透裂解变化,和蔗糖密度梯度离心“金标准”的其他细胞成分2,3,4,革兰阴性细菌OMS的物理分离和浓缩。而我们前面描述的这种方法的应用,为隔离两种类型OMS A和B型株的楼tularensis 5,此演示,提供了奥姆隔离更详细和优化的过程。事实上,这是一个从这种致命的病原体识别潜在的表面暴露和推定致病因素的重要进展。在此过程中的意义是表明我们给予实质性的保护,对剧毒A型楼纯化的外膜蛋白,免疫小鼠的实验室研究tularensis肺挑战6。如上所述,细菌细胞,在渗透裂解仔细监测,和温柔的再悬浮膜颗粒的生长阶段出现的关联,这种膜分离过程中的成功/失败的关键步骤。虽然这种优化方法是严谨和一些实验性的变异,导致OMS相比,从使用的洗涤剂,氯化锂,钠碳酸盐7,8,9,10,11囊括出现显着提高纯度 , 12。
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Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Donor calf serum | Mediatech | 35-022-CV | ||
IsoVitaleX | Becton Dickinson | 211876 | ||
Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech | 46-000-CM | ||
38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | ||
F50L-8×39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | ||
Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 04693132001 | ||
Benzonase | Novagen | 70664-3 | ||
DC protein assay | BioRad | 500-0116 | ||
Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman | 344060 | ||
SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 331301 | ||
Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |