から内側と外側の膜を分離するためのプロトコル<em>野兎病菌</em> spheroplasting、浸透圧溶解、およびショ糖密度勾配超遠心分離によって。
野兎病菌は、グラム陰性細胞内球桿菌と人獣共通感染症の野兎病の原因物質です。他の細菌性病原体と比較すると、極めて低い感染量(<10 CFU)、急激な病気の進行、および高い罹患率と死亡率は、 野兎の病原性菌株が新規な病原因子をコードすることを示唆している。表面に露出した分子、すなわち外膜タンパク質(OMPS)は、細菌宿主細胞結合、エントリ、細胞生存、病原性と免疫回避を促進することが示されている。 OMPSを研究するための妥当性は、さらに彼らは、細菌性疾患の数に対する保護ワクチンとして機能するという事実によって強調される。 OMPSを遠心分離および/または界面活性剤抽出に続いて細胞の超音波処理を含むバルク膜の抽出技術、を通じてグラム陰性細菌から抽出することができるのに対し、これらの製剤は多くの場合、ペリプラズムおよび/または細胞質(インナー)膜(IM)の汚染物質で汚染されている。長年にわたり、グラム陰性IMと外膜の生化学および生物物理学的分離のための"ゴールドスタンダード"方法は(OM)ショ糖密度勾配遠心分離に続いて、spheroplastingと浸透圧溶解されることが細菌になっている。一度、ショ糖勾配上に重ね、OMSが好調な密度の差に基づいて、IMSから分離することができる、主にOMのリポ多糖の存在(LPS)を前提としていると考えられ。ここで、我々は、抽出豊かに、そしてFを分離するために厳格な最適化方法を説明します病菌外膜とその関連OMPS。
このプロトコルはspheroplasting、浸透圧溶解の変化、および他の細胞成分2、3、4からグラム陰性細菌のOMSの物理的な分離と濃縮のためのショ糖密度勾配遠心分離"ゴールドスタンダード"を説明します。我々は以前に、両方のタイプとFのB型株からOMSを単離するためのこの方法の応用を説明したのに対し、 病菌 5は 、このプレゼンテーションは、OMの分離のための詳細かつ最適化された手順を提供しています。確かに、これはこの致命的な病原体から潜在的に表面に露出し、推定される病原性因子を特定するための重要な進歩である。この手順の重要性は、病原性のタイプF.に対する実質的な保護が与えOMPSを精製したマウスの免疫を示す私たちの研究室での研究で実証された病菌肺課題6。細菌細胞、浸透圧溶解時には特に注意して監視、および膜ペレットの穏やかな再懸濁の上記のように、成長期には、この膜分離の手続きの成功/失敗と相関して出現の重要なステップです。この最適化されたメソッドは厳しいといくつかの実験的なばらつきの対象となっている間、結果OMSは、洗剤、塩化リチウム、または炭酸ナトリウム7、8、9、10、11の使用から獲得に比べて格段に強化された純度のもののように見える12。
The authors have nothing to disclose.
説明されているプロジェクトは、NIAID / NIHから助成番号P01 AI055637とU54 AI057156によってサポートされていました。その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもRCEプログラムオフィス、NIAID、またはNIHの公式見解を示すものではありません。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Donor calf serum | Mediatech | 35-022-CV | ||
IsoVitaleX | Becton Dickinson | 211876 | ||
Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech | 46-000-CM | ||
38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | ||
F50L-8×39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | ||
Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 04693132001 | ||
Benzonase | Novagen | 70664-3 | ||
DC protein assay | BioRad | 500-0116 | ||
Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman | 344060 | ||
SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 331301 | ||
Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |