بروتوكول لفصل الأغشية الداخلية والخارجية من<em> الفرنسيسيلة التولارية</em> عن طريق تحلل ، spheroplasting التناضحي ، والسكروز تنبيذ فائق التدرج الكثافة.
الفرنسيسيلة التولارية هو عصورة سلبية الغرام بين الخلايا والعامل المسبب للمرض التلريات الحيوانية المنشأ. بالمقارنة مع غيرها من مسببات الأمراض البكتيرية ، وجرعة منخفضة للغاية المعدية (<10 CFU) ، تطور المرض بسرعة ، وارتفاع معدلات المراضة والوفيات تشير إلى أن سلالات قاتلة من الفرنسيسيلة ترميز لعوامل الفوعة الرواية. وقد تبين أن السطح المعرضة للجزيئات وبروتينات الغشاء الخارجي هي : (خطط إدارة المكاتب) ، لتعزيز البكتيرية الخلية المضيفة ملزمة ، دخول ، والبقاء داخل الخلايا ، والتهرب من الفوعة المناعي. وشدد كذلك على أهمية لدراسة خطط إدارة المكاتب من حقيقة أنها يمكن أن تكون بمثابة لقاحات واقية ضد عدد من الأمراض البكتيرية. في حين يمكن استخلاصها من خطط إدارة المكاتب البكتيريا سالبة الجرام من خلال غشاء معظم تقنيات الاستخراج ، بما في ذلك الخلايا صوتنة تليها الطرد المركزي و / أو استخراج مواد التنظيف ، وغالبا ما تكون ملوثة مع هذه الاستعدادات محيط بالجبلة و / أو حشوية (الداخلية) الملوثات (IM) الغشاء. لسنوات ، ان "المعيار الذهبي" طريقة لفصل الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية من سلبية الغرام والأغشية IM الخارجي (OM) تم رهنا للبكتيريا تحلل spheroplasting والتناضحي ، تليها كثافة السكروز الطرد المركزي التدرج. مرة واحدة على طبقات متدرجة السكروز ، يمكن فصل OMS من الرسائل الفورية على أساس الاختلافات في كثافة مرتفعة ويعتقد أن يستند إلى حد كبير على وجود lipopolysaccharide (LPS) في مرسيليا. هنا ، نحن تصف طريقة صارمة والأمثل لاستخراج وتخصيب ، وعزل F. الأغشية الخارجي التولارية وخطط إدارة المكاتب المرتبطة بها.
هذا البروتوكول وصف الاختلاف من تحلل ، spheroplasting التناضحي ، والسكروز الطرد المركزي المتدرج الكثافة "المعيار الذهبي" للفصل المادي وإثراء سلبية الغرام OMS بكتيرية من المكونات الخلوية الأخرى 2 ، 3 ، 4. في حين أننا سبق وصفها في تطبيق هذا الأسلوب لعزل OMS من كل نوع A و B سلالات نوع F. التولارية 5 ، يقدم هذا العرض إجراء أكثر تفصيلا والأمثل لعزل OM. في الواقع ، وهذا هو تقدم مهم لتحديد احتمال والسطحية المعرضة للعوامل الفوعة المفترض من هذا الممرض القاتل. وقد تجلى أهمية هذا الإجراء في الدراسات التي تبين ان مختبرنا تحصين الفئران مع خطط إدارة المكاتب المنقى توفير حماية كبيرة ضد نوع ضراوة A F. التولارية التحدي الرئوي 6. كما لوحظ اعلاه مرحلة النمو ، من الخلايا البكتيرية ، والرصد الدقيق خلال تحلل التناضحي ، وإعادة تعليق لطيف من غشاء الكريات هي الخطوات الحاسمة التي تظهر لربط مع نجاح / فشل هذا الغشاء الداخلي الانفصال. في حين أن هذا الأسلوب الأمثل هو دقيق ويخضع لبعض المتغيرات التجريبية ، ونظام إدارة العمليات الناتجة على ما يبدو من النقاء معززة بشكل ملحوظ بالمقارنة مع تلك التي حصل من استخدام المنظفات الصناعية ، وكلوريد الليثيوم ، وكربونات الصوديوم أو 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12.
The authors have nothing to disclose.
وأيد المشروع التي وصفها أرقام المنح P01 AI055637 وAI057156 U54 من NIAID / المعاهد الوطنية للصحة. محتوياته هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمكتب البرامج RCE ، NIAID ، أو المعاهد الوطنية للصحة.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Donor calf serum | Mediatech | 35-022-CV | ||
IsoVitaleX | Becton Dickinson | 211876 | ||
Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech | 46-000-CM | ||
38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | ||
F50L-8×39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | ||
Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 04693132001 | ||
Benzonase | Novagen | 70664-3 | ||
DC protein assay | BioRad | 500-0116 | ||
Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman | 344060 | ||
SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 331301 | ||
Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |