Este video muestra el protocolo de un ensayo de angiogénesis in vitro que recapitula varias etapas de la angiogénesis. Time-lapse imágenes de germinación, la formación del lumen, ramas y anastomosis – las características clave de la angiogénesis – se muestran.
Abstract
La angiogénesis es un complejo proceso de múltiples pasos, donde, en respuesta a estímulos angiogénicos, nuevos vasos son creados a partir de los vasos existentes. Estas medidas incluyen: la degradación de la membrana basal, proliferación y migración (brotes) de las células endoteliales (CE) en la matriz extracelular, la alineación de la CE en los cables, ramas, la formación del lumen, anastomosis y la formación de una nueva membrana basal. Muchos de los ensayos in vitro se han desarrollado para estudiar este proceso, pero la mayoría sólo imitar ciertas etapas de la angiogénesis, y morfológicamente los vasos en los ensayos a menudo no se parecen a los barcos en vivo. Basado en un trabajo anterior de Niels y Drenckhahn, hemos optimizado un ensayo de angiogénesis in vitro, que utiliza la vena umbilical humana CE y los fibroblastos. Este modelo recapitula todas las etapas clave al comienzo de la angiogénesis y, sobre todo, los vasos pantalla patente lúmenes intercelular rodeado de polarización CE. CE se aplica sobre microportadores cytodex y embebido en un gel de fibrina. Los fibroblastos son en capas en la parte superior del gel donde se presten los necesarios factores solubles que promueven la CE que brotan de la superficie de los granos. Después de varios días, numerosos vasos que están presentes se puede observar fácilmente en contraste de fases y microscopía lapso de tiempo. Este video muestra los pasos clave en la creación de estas culturas.
Protocol
CÉLULAS PREPARACIÓN Abrir HUVEC y fibroblastos en M199/10% de SFB / Pen-estreptococo (1:100) 1-2 días antes de abalorios. Interruptor de medio EGM-2 (Clonetics) el día antes de abalorios para HUVEC y el día antes de la incrustación de los fibroblastos. Una concentración de aproximadamente 400 bolas por HUVEC es necesario. 20.000 fibroblastos por bien que se necesita. RECUBRIMIENTO las cuentas con HUVEC – día -1 Trypsinize HUVEC….
Discussion
Existe un consenso creciente de que en tres dimensiones (3D) en los ensayos de la angiogénesis in vitro ofrecen un modelo que está mucho más cerca el entorno real en vivo que se puede lograr a partir de cultivos en 2D. Es evidente que los sistemas superiores de 3D debe ser reproducible, y ser capaz de imitar a varios de los pasos más importantes de la angiogénesis. Mientras que varios ensayos previa en 3D han sido desarrollados, muchos de estos o bien utilizar difíciles de obtener células microvasculares, o sólo recapitular algunas …
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Cytodex-3 Beads
Reagent
Amersham Pharmacia
17-0485-01
10 g/bottle.
1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT.
Use a 50 mL tube and place it on the rocker.
2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).
3. Discard the PBS and replace with fresh PBS:
25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or
50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL
4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).
5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C.
6. Store it at 4C.
Aprotinin
Reagent
Sigma
A-1153
10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C.
Fibrinogen Type I
Reagent
Sigma
F-8630
1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS
Note clottable protein % and adjust accordingly
Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.
Sterile filter through 0.22 um
Thrombin
Reagent
Sigma
T-3399
22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C.
Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186, doi:10.3791/186 (2007).