هذا الفيديو يوضح بروتوكول لفحص الأوعية الدموية في المختبر الذي يلخص مراحل عديدة من الأوعية الدموية. وتظهر — الوقت الفاصل بين الصور التي تنتشر من وتشكيل التجويف ، والمتفرعة مفاغرة — الملامح الرئيسية الأوعية الدموية.
Abstract
الأوعية الدموية هي عملية معقدة متعددة الخطوات العملية ، حيث ، وذلك استجابة لمحفزات عائية ، يتم إنشاء السفن الجديدة من الأوعية الدموية الموجودة. وتشمل هذه الخطوات : تدهور انتشار الطابق السفلي ، والغشاء والهجرة (تنبت) من الخلايا البطانية (EC) في المصفوفة خارج الخلية ، والمحاذاة من المفوضية الأوروبية في الحبال ، المتفرعة ، وتشكيل التجويف ، مفاغرة ، وتشكيل الغشاء القاعدي الجديد. وقد وضعت العديد من فحوصات المختبر لدراسة هذه العملية ، ولكن معظم فقط تحاكي مراحل معينة من الأوعية الدموية ، وتتشابه هذه السفن في المقايسات في كثير من الأحيان لا تشبه السفن في الجسم الحي. استنادا إلى الأعمال السابقة التي Nehls وDrenckhahn ، وقد الأمثل لدينا خبير في الفحص المختبري الأوعية الدموية التي تستخدم الإنسان السري EC الوريد والليفية. يلخص هذا النموذج جميع المراحل المبكرة من الأوعية الدموية الرئيسية ، والأهم ، والسفن عرض براءات الاختراع بين الخلايا شمعة محاطة EC الاستقطاب. والمغلفة EC على microcarriers cytodex وجزءا لا يتجزأ الى هلام الليفين. والطبقات الليفية على رأس الجل حيث أنها توفر العوامل اللازمة للذوبان التي تشجع المفوضية الأوروبية التي تنتشر من سطح الخرز. بعد عدة أيام ، والعديد من السفن موجودة التي يمكن بسهولة أن يلاحظ التباين في إطار المرحلة والمجهري مرور الزمن. هذا الفيديو يوضح الخطوات الأساسية في إعداد هذه الثقافات.
Protocol
تحضير الخلايا إحضار HUVEC والخلايا الليفية في M199/10 ٪ FBS / PEN – بكتيريا (1:100) 1-2 قبل أيام من الديكور. التبديل المتوسط إلى EGM – 2 (Clonetics) قبل يوم واحد لHUVEC الديكور والنهار قبل التضمين لالليفية. <li style…
Discussion
هناك إجماع متنام بأن ثلاثية الأبعاد (3D) في الأوعية الدموية فحوصات المختبر تقديم نموذج الذي هو أقرب إلى البيئة الفعلية في الجسم الحي مما يمكن تحقيقه باستخدام 2D الثقافات. فمن الواضح أن نظم 3D متفوقة ينبغي استنساخه ، وتكون قادرة على محاكاة العديد من الخطوات الرئيسية في الأوعية الدم?…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Cytodex-3 Beads
Reagent
Amersham Pharmacia
17-0485-01
10 g/bottle.
1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT.
Use a 50 mL tube and place it on the rocker.
2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).
3. Discard the PBS and replace with fresh PBS:
25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or
50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL
4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).
5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C.
6. Store it at 4C.
Aprotinin
Reagent
Sigma
A-1153
10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C.
Fibrinogen Type I
Reagent
Sigma
F-8630
1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS
Note clottable protein % and adjust accordingly
Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.
Sterile filter through 0.22 um
Thrombin
Reagent
Sigma
T-3399
22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C.
Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186, doi:10.3791/186 (2007).