Это видео демонстрирует протокол в анализе ангиогенеза пробирке, что повторяет несколько стадий ангиогенеза. Покадровый изображения прорастания, просвет образования, ветвление и анастомоза – ключевые особенности ангиогенез – это показано на рисунке.
Abstract
Ангиогенез представляет собой сложный многоступенчатый процесс, в котором, в ответ на ангиогенных стимулы, новые суда создаются из существующих сосудов. Эти шаги включают в себя: деградации базальной мембраны, пролиферации и миграции (прорастание) эндотелиальных клеток (ЕК) в внеклеточного матрикса, выравнивания ЕС в шнуры, ветвящийся, просвет образования, анастомоза, и формирование новой базальной мембраны. Многие в пробирке тесты были разработаны для изучения этого процесса, но большинство лишь имитируют определенные этапы ангиогенеза, и морфологически судов в анализах часто не похожи на судах в естественных условиях. На основе более ранних работ Nehls и Drenckhahn, мы оптимизировали в пробирке ангиогенеза анализа, который использует пупочной вены человека ЕС и фибробластов. Эта модель повторяет все ключевые ранних стадий ангиогенеза и, что немаловажно, судов дисплей патент межклеточных люмен окруженной поляризованной ЕС. ЕС покрыты на микроносителях cytodex и встроенных в гель фибрина. Фибробласты слой поверх геля, где они обеспечивают необходимый растворимых факторов, которые способствуют прорастанию ЕС с поверхности бусины. После нескольких дней, многочисленные суда присутствуют, которые можно легко наблюдается при фазово-контрастной и покадровой микроскопии. Это видео демонстрирует основные этапы в создании этих культур.
Protocol
ПОДГОТОВКА КЛЕТОК Вызовите HUVEC и фибробластов в M199/10% FBS / Пен-Strep (1:100) за 1-2 дня до бисером. Коммутатор средних EGM-2 (Clonetics) день до бисером для HUVEC и позавчера вложение для фибробластов. Концентрация ~ 400 HUVEC в шарик не требуется. 20000 фибробластов на лунку необходимо. <…
Discussion
Существует растущий консенсус, что трехмерная (3D) в анализах пробирке ангиогенеза предлагаем модель, которая гораздо ближе к реальной среде, чем в естественных условиях можно добиться, используя 2D культур. Очевидно, что превосходное 3D-системы должны быть воспроизводимы, и будут способны имитиров?…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Cytodex-3 Beads
Reagent
Amersham Pharmacia
17-0485-01
10 g/bottle.
1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT.
Use a 50 mL tube and place it on the rocker.
2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).
3. Discard the PBS and replace with fresh PBS:
25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or
50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL
4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).
5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C.
6. Store it at 4C.
Aprotinin
Reagent
Sigma
A-1153
10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C.
Fibrinogen Type I
Reagent
Sigma
F-8630
1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS
Note clottable protein % and adjust accordingly
Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.
Sterile filter through 0.22 um
Thrombin
Reagent
Sigma
T-3399
22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C.
Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186, doi:10.3791/186 (2007).