Bu protokol KLRG1 ligandların analizi için güçlü bir araçtır KLRG1 tetramer, üretim açıklamaktadır.
Abstract
Öldürücü hücre lektin-benzeri reseptör G1 (KLRG1) C tipi lektin-benzeri süperailesinin ait bir tip II transmembran glikoprotein inhibitör reseptör. KLRG1 bir monomer olarak ve bir disülfit bağlantılı homodimer olarak var. Bu iyi korunmuş reseptör, en olgun ve en yakın zamanda aktif NK hücreleri gibi efektör / bellek T hücrelerinin bir alt kümesi bulunur.
KLRG1 tetramer yanı sıra diğer yöntemleri kullanarak, E, K, ve R-cadherins KLRG1 ligandlar olarak tespit edilmiştir. Bu Ca 2 + bağımlı hücre-hücre adezyon molekülleri, hücre-hücre etkileşimleri, bir transmembran bir etki alanı ve aktin hücre iskeletinin bağlı bir sitoplazmik etki alanı için sorumlu beş kaderin tekrarlar içeren bir ekstrasellüler etki oluşur.
KLRG1 tetramer Üretimi KLRG1 ligandlar belirlenmesi için gerekli idi. KLRG1 tetramer immün yanıt ve doku bütünlüğünü düzenleyen rolleri cadherin ve KLRG1 oyun aydınlatmak için de eşsiz bir araç.
Protocol
İçerme Organları Hazırlanması TB 4 x 500 ml'lik şişeler İnokülasyon her bir gecede KLRG1 plazmid inşa ifade bakteri kültürü ile 50 mcg / ml carbenicillin ve kloramfenikol içeren. OD 600 nm dalga boyunda 0.6 Å ulaştığında, 37 ilavesi ile 0.4 M IPTG neden ve kültür sallayarak ek bir 4 saat inkübe ° C Hasat edilen hücrelerin tabanda tampon pH = 8.0 (50 mM Tris-HCl,% 25 (W / V), sukroz, 1 mM EDTA, 10 mM DTT) süspanse edin. Not: Bu aşamada pelet dondurulabilir. Pol…
Discussion
Bu protokol, bu biotinylate arındırmak için nasıl gösterildiği ve tetramerize KLRG1. KLRG1 tetramer flow sitometri KLRG1 ligandlar etiketlemek için kullanılabilir. Refolding koşulları her protein için ampirik olarak test edilmesi olsa da, diğer C-tipi lektin benzer bir protokol kullanılarak tetramerized olabilir. Problar, C-tipi lektin reseptörleri yetim ligandlar olarak tetramerized proteinleri kullanarak potansiyel olarak tespit edilebilir.
Acknowledgements
Biz Dr. Naidenko refolding koşulları optimize yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, araştırma hibe AI58181 tarafından desteklenen Laurent Brossay. Cindy Banh NIH NRSA F31 AI080230 tarafından desteklenmektedir.
Stephanie Terrizzi ve Cindy Banh bu çalışmaya katkıda bulunur.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
BirA Enzyme and Buffer
Biotinylation Kit
Avidity
BIRA500
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free