פרוטוקול זה מתאר את ייצור KLRG1 tetramer, אשר הוא כלי רב עוצמה לניתוח KLRG1 ligands.
Abstract
תא רוצח לקטינים כמו קולטן ה-G1 (KLRG1) הוא סוג II הטרנסממברני גליקופרוטאין קולטן מעכבות השייכים superfamily לקטינים כמו סוג ג'. KLRG1 קיים הן מונומר וכן homodimer דיסולפיד צמודות. קולטן זה היטב נשמרת נמצא על תאים NK בוגרת ביותר הופעל לאחרונה, כמו גם על קבוצת תאים T מפעיל / זיכרון.
שימוש KLRG1 tetramer כמו גם שיטות אחרות, דואר, N-, ו-R-cadherins זוהו KLRG1 ligands. אלה Ca 2 + תלויי תאים תאים מולקולות הדבקה כוללת של תחום תאי המכיל חמש חזרות cadherin אחראי תאים תאים אינטראקציות, תחום הטרנסממברני ואת תחום cytoplasmic המקושר cytoskeleton אקטין.
הדור של tetramer KLRG1 היה חיוני לזיהוי של KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer היא גם כלי ייחודי כדי להבהיר את cadherin תפקידים לשחק KLRG1 בוויסות התגובה החיסונית ושלמות הרקמות.
Protocol
הכנת גופים הכללה לחסן 4 x 500 מ"ל צלוחיות של שחפת שכל אחת מהן מכילה 50 מיקרוגרם / מ"ל ו carbenicillin chloramphenicol עם תרבות הלילה של חיידקים ביטוי לבנות KLRG1 פלסמיד. כאשר מגיע OD 0.6 בבית 600 ננומטר, להשרות עם תוספת של 0.4 M ו – IPTG דגירה …
Discussion
בפרוטוקול זה, הראה כיצד לטהר, biotinylate ו KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetramer ניתן להשתמש בתווית KLRG1 ligands ידי cytometry הזרימה. למרות התנאים refolding יצטרך להיבדק באופן אמפירי של חלבון זה לזה, C-סוג לקטינים יכול להיות tetramerized באמצעות פרוטוקול דומה. באמצעות חלבונים tetramerized כמו בדיקות, ligands ל-C מסוג קול?…
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר Naidenko עזרה אופטימיזציה התנאים refolding. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק מחקר AI58181 אל לורן Brossay. סינדי Banh נתמך על ידי NIH NRSA F31 AI080230.
סטפני Terrizzi וסינדי Banh לתרום באופן שווה על עבודה זו.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
BirA Enzyme and Buffer
Biotinylation Kit
Avidity
BIRA500
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free