Этот протокол описывает производство KLRG1 тетрамер, который является мощным инструментом для анализа KLRG1 лигандами.
Abstract
Убийца ячейки лектин-подобный рецептор G1 (KLRG1) является трансмембранный гликопротеин II типа тормозных рецепторов принадлежащих тип С лектин-подобный надсемейства. KLRG1 существует как мономер и как дисульфид-связанных гомодимера. Это хорошо сохраняется рецептор находится на самых зрелых и недавно активированных NK клеток, а также на подмножестве эффектор / память Т-клеток.
Использование KLRG1 тетрамер, а также другие методы, E-, N-, и R-кадгерины были определены как KLRG1 лигандами. Эти Са 2 +-зависимые межклеточных молекул адгезии состоит из внеклеточного домена, содержащий пять кадгерина повторяет ответственность за межклеточных взаимодействий, трансмембранный домен и цитоплазматический домен, который связан с актином цитоскелета.
Генерация KLRG1 тетрамер имеет важное значение для идентификации KLRG1 лигандами. KLRG1 тетрамер также уникальный инструмент для выяснения роли кадгерина и KLRG1 играть в регуляции иммунного ответа и целостности тканей.
Protocol
Подготовка тел включения Привить 4 х 500 мл колб ТБ каждый из которых содержит 50 мкг / мл карбенициллин и хлорамфеникол с ночной культуры бактерий выражения KLRG1 плазмиды конструкции. Когда OD достигает 0,6 А при 600 нм, вызывают с добавлением 0,4 М IPTG и инкубировать культуру дополнительно …
Discussion
В этом протоколе, показано, как очистить, biotinylate и tetramerize KLRG1. KLRG1 тетрамер могут быть использованы для обозначения KLRG1 лигандов с помощью проточной цитометрии. Хотя рефолдинг условия должны быть проверены эмпирически для каждого белка, других C-типа лектинов может быть tetramerized использова?…
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Найденко за помощь в оптимизации рефолдинг условиях. Эта работа была поддержана исследовательский грант NIH AI58181 Лорана Brossay. Синди Banh поддерживается NIH НРСА F31 AI080230.
Стефани Terrizzi и Синди Banh в равной мере участвовать в этой работе.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
BirA Enzyme and Buffer
Biotinylation Kit
Avidity
BIRA500
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free