Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) en Nicotiana benthamiana Y tomate
Summary
Descripción de un virus inducida por silenciamiento génico (VIGS) método de derribo de la expresión génica en<em> Nicotiana benthamiana</em> Y el tomate.
Abstract
ARN de interferencia (ARNi) es una muy específica silenciamiento génico fenómeno desencadenado por dsRNA 1. Este mecanismo de silenciamiento utiliza dos clases principales de los reguladores de ARN: los microRNAs, que se producen a partir de los genes que codifican proteínas y ARN corto de interferencia (siRNA). Las plantas utilizan la RNAi para controlar los transposones y ejercer un estricto control sobre los procesos de desarrollo tales como la formación de órganos florales y desarrollo de las hojas 2,3,4. Las plantas también el uso de RNAi para defenderse de la infección por virus. En consecuencia, muchos virus han evolucionado de silenciamiento de genes supresores de permitir la colonización exitosa de su anfitrión 5.
Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) es un método que se aprovecha de la planta mediante RNAi mecanismo de defensa antiviral. En las plantas infectadas con el virus sin modificar el mecanismo está dirigido específicamente contra el genoma viral. Sin embargo, con los vectores de virus que lleva las secuencias derivadas de los genes del hospedador, el proceso puede ser, además, dirigidos contra el ARNm de host correspondiente. VIGS ha sido adaptado de alto rendimiento para la genómica funcional en plantas mediante el uso de los patógenos de plantas Agrobacterium tumefaciens para ofrecer, a través de su plásmido Ti, un virus recombinante que lleva la totalidad o parte de la secuencia del gen diana para silenciar. Propagación del virus y la endógena sistémica planta de RNAi maquinaria cuidar de los demás. dsRNAs correspondiente a la meta de genes se producen y se escinde luego por la ribonucleasa Dicer en siRNA de 21 a 24 nucleótidos de longitud. Estos siRNAs en última instancia, la Guía del silenciamiento inducido por ARN complejo (RISC) para degradar la transcripción de la meta 2.
Diferentes vectores se han utilizado en VIGS y uno de los más utilizados se basa en el tabaco sonajero virus (TRV). TRV es un virus bipartito y, como tales A., dos diferentes tumefaciens cepas se utilizan para VIGS. Uno lleva pTRV1, que codifica las funciones de replicación viral y el movimiento mientras que el otro, pTRV2, alberga la proteína de la cubierta y la secuencia utilizada para VIGS 6,7. La inoculación de Nicotiana benthamiana y plántulas de tomate con una mezcla de ambas cepas de resultados en el silenciamiento de genes. El silenciamiento de la endógena fitoeno desaturasa (PDS) de genes, lo que hace que photobleaching, se utiliza como control de la eficiencia VIGS. Cabe señalar, sin embargo, que el silenciamiento de tomate suele ser menos eficiente que en N. benthamiana. La abundancia de transcripción de ARN del gen de interés siempre se debe medir para asegurarse de que el objetivo de genes de manera eficiente ha sido regulados. Sin embargo, las secuencias de genes heterólogos de N. benthamiana puede ser utilizado para silenciar a sus respectivos orthologs en el tomate y viceversa 8.
Protocol
Discussion
Inducida por el virus de silenciamiento génico es un método que permite una rápida pantallas de genética inversa. Evita la generación de T-ADN o genes transposón mediada por knock-out, que sólo están disponibles en ciertas plantas como Arabidopsis y el maíz. También se evita el proceso que lleva tiempo de transformación de la planta y permite la focalización de los múltiples genes al mismo tiempo, siempre que tengan suficiente homología de 10 o de que las diferentes secuencias de host d…
Acknowledgements
Agradecemos a la Dra. Patricia Manosalva por su valiosa información sobre el manuscrito. El financiamiento fue proporcionado por el Programa Nacional de Ciencia Fundación Genoma Vegetal, el número de premios DBI-0605059.
References
- Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet. 17, 449-459 (2001).
- Carrington, J. C., Ambros, V. Role of microRNAs in plant and animal development. Science. 301, 336-338 (2003).
- Chen, X. A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development. Science. 303, 2022-2025 (2004).
- Palatnik, J. F. Control of leaf morphogenesis by microRNAs. Nature. 425, 257-263 (2003).
- Brigneti, G. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J. 17, 6739-6746 (1998).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant Journal. 31, 777-786 (2002).
- MacFarlane, S. A. Molecular biology of the tobraviruses. J. Gen. Virol. 80, 2799-2807 (1999).
- Senthil-Kumar, M. A systematic study to determine the extent of gene silencing in Nicotiana benthamiana and other Solanaceae species when heterologous gene sequences are used for virus-induced gene silencing. New Phytol. 176, 782-791 (2007).
- McCullen, C. A., Binns, A. N. Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 101-127 (2006).
- Rosebrock, T. R. A bacterial E3 ubiquitin ligase targets a host protein kinase to disrupt plant immunity. Nature. 448, 370-374 (2007).
- Miki, D., Itoh, R., Shimamoto, K. RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice. Plant Physiol. 138, 1903-1913 (2005).
- Voinnet, O. Use, tolerance and avoidance of amplified RNA silencing by plants. Trends Plant Sci. 13, 317-328 (2008).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Kumar-Dinesh, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Liu, E., Page, J. E. Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus. Plant. Methods. 4, 5-5 (2008).
