Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat
Summary
Beschrijving van een virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) methode voor de knock-down van genexpressie in<em> Nicotiana benthamiana</em> En tomaat.
Abstract
RNA-interferentie (RNAi) is een zeer specifiek gen-silencing fenomeen veroorzaakt door een dsRNA. Dit zwijgen op te leggen mechanisme maakt gebruik van twee grote klassen van RNA toezichthouders: microRNA's, die geproduceerd worden uit niet-eiwit-coderende genen en short interfering RNA's (siRNA's). Planten gebruiken RNAi om transposons controle en strakke controle over ontwikkelingsprocessen zoals bloem orgel vorming en de bladontwikkeling 2,3,4 uit te oefenen. Planten ook gebruik maken van RNAi om zichzelf te verdedigen tegen infecties door virussen. Bijgevolg hebben veel virussen geëvolueerd onderdrukkers van gene silencing om hun succesvolle kolonisatie van hun gastheer 5 mogelijk te maken.
Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) is een methode die gebruik maakt van de plant RNAi-gemedieerde antiviraal verdedigingsmechanisme. Bij planten die besmet zijn met niet-gemodificeerde virussen het mechanisme is specifiek gericht tegen het virale genoom. Echter, met virus vectoren die sequenties afgeleid van gastheer genen, kan het proces bovendien gericht tegen de corresponderende gastheer mRNA's. VIGS is aangepast voor high-throughput functionele genomica in planten met behulp van de plant pathogeen Agrobacterium tumefaciens te leveren, via de Ti-plasmide, een recombinant virus dragen van de gehele of een deel van de gensequentie gericht op zwijgen. Systemische verspreiding van het virus en de endogene plant RNAi machines zorgen voor de rest. dsRNA's die overeenkomen met de target-gen worden geproduceerd en vervolgens gesplitst door de ribonuclease Dicer in siRNA's van 21 tot 24 nucleotiden in lengte. Deze siRNA's uiteindelijk leiden de RNA-silencing geïnduceerde complex (RISC) om het doel transcript twee degraderen.
Verschillende vectoren zijn tewerkgesteld in VIGS en een van de meest gebruikte is gebaseerd op tabak rammelaar virus (TRV). TRV is een tweedelig virus en als zodanig, twee verschillende A. tumefaciens stammen worden gebruikt voor VIGS. Een draagt pTRV1, die de replicatie en beweging virale functies codeert, terwijl de andere, pTRV2, havens de vacht eiwit en de sequentie die wordt gebruikt voor de VIGS 6,7. Inoculatie van Nicotiana benthamiana en tomaat zaailingen met een mengsel van beide stammen resulteert in een gen-silencing. Monddood maken van de endogene phytoene desaturase (PDS)-gen, waardoor fotobleken, wordt gebruikt als een controle voor VIGS efficiency. Hierbij moet echter worden opgemerkt, dat de silencing in tomaat is meestal minder efficiënt dan in N. benthamiana. RNA transcript overvloed van het gen van belang moet altijd worden gemeten om ervoor te zorgen dat de doelstelling-gen efficiënt is down-gereguleerd. Toch heterologe gen-sequenties uit N. benthamiana kan worden gebruikt om hun respectievelijke orthologen stilte in tomaat en vice versa 8.
Protocol
Discussion
Virus-geïnduceerde gene silencing is een methode die snel omgekeerde genetische screens mogelijk maakt. Het vermijdt de generatie van T-DNA of transposon gemedieerde gen knock-outs, die alleen beschikbaar zijn in bepaalde planten zoals Arabidopsis en maïs. Het omzeilt ook de tijdrovende proces van plant transformatie en maakt de gerichtheid van meerdere genen op hetzelfde moment, op voorwaarde dat ze voldoende homologie 10 of dat andere host doelsequenties zijn gerangschikt in tandem in het zwijgen…
Acknowledgements
Wij danken dr. Patricia Manosalva voor haar waardevolle inzichten op het manuscript. De financiering werd verstrekt door de National Science Foundation Plant Genome Program, award aantal DBI-0605059.
References
- Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet. 17, 449-459 (2001).
- Carrington, J. C., Ambros, V. Role of microRNAs in plant and animal development. Science. 301, 336-338 (2003).
- Chen, X. A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development. Science. 303, 2022-2025 (2004).
- Palatnik, J. F. Control of leaf morphogenesis by microRNAs. Nature. 425, 257-263 (2003).
- Brigneti, G. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J. 17, 6739-6746 (1998).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant Journal. 31, 777-786 (2002).
- MacFarlane, S. A. Molecular biology of the tobraviruses. J. Gen. Virol. 80, 2799-2807 (1999).
- Senthil-Kumar, M. A systematic study to determine the extent of gene silencing in Nicotiana benthamiana and other Solanaceae species when heterologous gene sequences are used for virus-induced gene silencing. New Phytol. 176, 782-791 (2007).
- McCullen, C. A., Binns, A. N. Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 101-127 (2006).
- Rosebrock, T. R. A bacterial E3 ubiquitin ligase targets a host protein kinase to disrupt plant immunity. Nature. 448, 370-374 (2007).
- Miki, D., Itoh, R., Shimamoto, K. RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice. Plant Physiol. 138, 1903-1913 (2005).
- Voinnet, O. Use, tolerance and avoidance of amplified RNA silencing by plants. Trends Plant Sci. 13, 317-328 (2008).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Kumar-Dinesh, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Liu, E., Page, J. E. Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus. Plant. Methods. 4, 5-5 (2008).
