Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama
Summary
Bu video C. elegans dopaminerjik nöron nörodejenerasyon, Parkinson hastalığı için bir model olarak değerlendirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, genetik ekranlar ya dejenerasyon geliştirmek veya nöroprotektif faktörleri tanımlamak için kullanılır.
Abstract
Parkinson hastalığı (PH) tanı ve tedavi gelişmeler, risk altındaki populasyonlarda hale yatkınlık faktörleri hakkında bilgi bağımlı. PD ile ilişkili yeni bir genetik faktörleri belirlemek için çalışırken sürecinde, bilim adamları, aday genler, polimorfizmleri ve önemli ilerlemeler temsil eden proteinler birçok listeler oluşturulur, ancak bu yol açar mekanistik tanımsız kalır. Bizim işimiz böyle listelere basit bir hayvan modeli sisteminin avantajlarını istismar ederek önemli ölçüde daralması doğru hedeflenmektedir. Insanlar milyarlarca nöron olmasına rağmen, mikroskopik tür solucanın Caenorhabditis elegans tam 302 var ve bunların sadece sekiz hemaphrodites üretmek dopamin (DA). İfade bir insan gen dozaj ve yaşa bağımlı nörodejenerasyon C. elegans DA nöronlar sonuçları PD-ilişkili protein, alfa-sinüklein kodlama.
DA nöronların insan alfa-sinüklein ifade Worms isogenic ve DA taşıyıcı organizatörü (Pdat 1) altında GFP ve insan alfa-sinüklein ifade. GFP varlığı kolayca görüntülenebilmekte, bu hayvanlar DA nörodejenerasyon için bir marker olarak hizmet vermektedir. Biz başlangıçta alfa-sinüklein indüklenen DA nörodejenerasyon torsinA, moleküler şaperon aktivite 1 ile bir protein tarafından bu hayvanlar kurtarıldı olabileceğini gösterdi. Ayrıca, aday PD-ilişkili genlerin sonra C. elegans DA nöronların aşırı ifade edildi alfa-sinüklein misfolding assay kullanarak büyük ölçekli RNAi tarama çabaları ile laboratuvar belirlemiştir. Biz alfa-sinüklein indüklenen DA nörodejenerasyon 2 kurtardı beş yedi genlerin PD temsil önemli aday modülatörleri test olduğunu belirledi. Ayrıca, alfa-sinüklein bağımlı toksisite sitotoksisite geliştirmek veya bastırmak genler için bir okuma olarak kullanılmasını sağlayan Lindquist Lab (vallahi bu konuda) maya ekranlarında sahne aldı. Biz daha sonra C. elegans alfa-sinüklein indüklenen nörodejenerasyon tahlil maya aday genler incelenecek ve başarılı bir şekilde bu hedeflere 3, 4 çok valide .
Metodoloji Pdat-1 promotör kontrolü altında aday gen cDNAs recombinational klonlama kullanarak C. elegans DA nöron spesifik ifade vektör nesil içerir. Bu plazmid sonra başarılı bir dönüşüm için seçilebilir bir işaret ile birlikte, wild-tip (N2) solucanlar microinjected. DA nöronları aday proteini üreten Çoklu istikrarlı transgenik çizgiler yaşlanma boyunca, hayvan ve bireysel nöron düzeyinde hem de elde edilen ve daha sonra bağımsız olarak geçti ve alfa-sinüklein dejeneratif gerginlik içine nörodejenerasyon açısından değerlendirildi.
Protocol
Discussion
Dopamin nöronlarının yaşa bağlı kayıp, Parkinson hastalığının bir klinik özelliğidir ve alfa-sinüklein adı verilen bir protein birikimi veya misfolding ile ilişkili bulunmuştur. Burada C dopaminerjik nöronlar, floresan transgen üzerinden, etiket nasıl göstermek elegans ve bu hücrelerin coexpressing insan alfa-sinüklein Parkinson hastalığında görülen nörodejenerasyon taklit.
Bu video, büyüme, genetik geçişi, montaj ve nörodejenerasyon ya da geliştirmek veya yaşlanma boyunca nöro-…
Acknowledgements
Biz tüm Caldwell Lab üyeleri işbirliği ruhu kabul etmek istiyoruz. Bachmann-Strauss Distoni ve Parkinson Vakfı, Birleşik Parkinson Vakfı, Amerikan Parkinson Hastalığı Derneği, Parkinson Hastalığı Derneği Alabama, Michael J. Fox Parkinson Araştırma Vakfı ve Lisans Araştırma laboratuarında Hareket bozuklukları araştırma tarafından desteklenmektedir
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Microscope Slides | Plain, 3×1″ | Fisher | 12-549 | |
| Dissecting with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Epifluorescent | Microscope | Nikon | Model E-800 | |
| Filter Cube, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology |
References
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
- Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -. C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson’s disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).
