L'applicazione di una degenerazione C. elegans Dopamina Saggio Neuron per la convalida dei potenziali morbo di Parkinson geni
Summary
Questo video illustra come utilizzare C. elegans per valutare neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici come modello per la malattia di Parkinson. Inoltre, gli schermi genetici sono usati per identificare i fattori che o migliorare la degenerazione o sono neuroprotettivi.
Abstract
Miglioramenti per la diagnosi e il trattamento della malattia di Parkinson (PD) dipendono le conoscenze sui fattori di suscettibilità che rendono le popolazioni a rischio. Nel processo di tentare di identificare nuovi fattori genetici associati a PD, gli scienziati hanno generato molte liste di geni candidati, polimorfismi, e le proteine che rappresentano importanti passi avanti, ma questi cavi rimangono meccanicisticamente indefinito. Il nostro lavoro si rivolge in modo significativo restringimento verso tali elenchi, sfruttando i vantaggi di un sistema semplice modello animale. Mentre gli esseri umani hanno miliardi di neuroni, il microscopico verme Caenorhabditis elegans ha precisamente 302, di cui solo otto producono dopamina (DA) in hemaphrodites. Espressione di un gene umano che codifica per il PD-proteina associata, l'alfa-sinucleina, in C. elegans DA risultati neuroni nel dosaggio e dipendente dall'età neurodegenerazione.
Worm che esprimono umano alfa-sinucleina nei neuroni DA vengono isogeniche ed esprimono sia la GFP e umano alfa-sinucleina sotto il promotore trasportatore DA (Pdat-1). La presenza di GFP serve come marcatore per seguire facilmente visualizzati neurodegenerazione DA in questi animali. Inizialmente abbiamo dimostrato che l'alfa-sinucleina indotta neurodegenerazione DA potrebbe essere salvato in questi animali da torsinA, una proteina con attività di chaperone molecolare 1. Inoltre, candidato PD-correlati geni identificati nel nostro laboratorio attraverso grandi sforzi di screening RNAi con un alfa-sinucleina saggio misfolding sono stati poi sovra-espresso in C. elegans DA neuroni. Abbiamo determinato che cinque dei sette geni testati rappresentato modulatori candidato significative del PD in quanto salvato alfa-sinucleina indotta DA neurodegenerazione 2. Inoltre, il Laboratorio Lindquist (questo numero di Giove) si è esibito schermi lievito per cui alfa-sinucleina-dipendente tossicità è usato come una lettura di geni che possono aumentare o sopprimere citotossicità. Abbiamo poi esaminato i geni di lievito candidato nel nostro C. elegans alfa-sinucleina indotta saggio neurodegenerazione e convalidato correttamente molti di questi obiettivi 3, 4.
La nostra metodologia prevede la generazione di C. elegans DA neurone specifico vettore di espressione tramite la clonazione di ricombinazione cDNA gene candidato sotto il controllo del Pdat-1 promotore. Questi plasmidi sono poi microiniettati nel wild-type (N2) vermi, insieme a un marcatore per la trasformazione di successo. Più linee transgeniche stabili produrre la proteina nei neuroni DA candidato si ottengono e poi attraversato in modo indipendente l'alfa-sinucleina ceppo degenerative e valutati per la neurodegenerazione, sia l'animale e il livello di singolo neurone, nel corso del tempo.
Protocol
Discussion
L'età-dipendente la perdita dei neuroni dopaminergici è una caratteristica clinica del morbo di Parkinson ed è stata associata con l'accumulo o misfolding di una proteina chiamata alfa-sinucleina. Qui mostriamo come etichettare, attraverso un transgene fluorescente, i neuroni dopaminergici di C. elegans e imitare la neurodegenerazione nella malattia di Parkinson da coexpressing umano alfa-sinucleina in queste cellule.
Questo video illustra la metodologia per la crescita, incrocio genetico, montaggio, e il puntegg…
Acknowledgements
Vogliamo riconoscere lo spirito di cooperazione di tutti i membri Lab Caldwell. Disturbi del movimento di ricerca in laboratorio è stato sostenuto dalla Bachmann-Strauss Fondazione Parkinson e distonia, Regno Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, il morbo di Parkinson Associazione dell'Alabama, Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research, e una ricerca di laurea
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Microscope Slides | Plain, 3×1″ | Fisher | 12-549 | |
| Dissecting with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Epifluorescent | Microscope | Nikon | Model E-800 | |
| Filter Cube, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology |
References
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
- Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -. C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson’s disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).
