Este vídeo demonstra como usar C. elegans para avaliar neurônio dopaminérgico neurodegeneração como um modelo para a doença de Parkinson. Além disso, as telas genéticos são usados para identificar os fatores que quer aumentar a degeneração ou neuroprotetor.
Melhorias para o diagnóstico e tratamento da doença de Parkinson (DP) são dependentes de conhecimentos sobre os fatores que tornam a susceptibilidade populações em risco. No processo de tentar identificar novos fatores genéticos associados com a DP, os cientistas têm gerado muitas listas de genes candidatos, polimorfismos, e proteínas, que representam avanços importantes, mas estas ligações permanecem mecanicamente indefinido. Nosso trabalho estará voltado para a redução significativa tais listas, explorando as vantagens de um sistema simples de animais modelo. Enquanto os seres humanos têm bilhões de neurônios, a lombriga microscópica Caenorhabditis elegans tem precisamente 302, dos quais apenas oito produzir dopamina (DA) em hemaphrodites. Expressão de um gene humano que codifica a proteína PD-associados, alfa-sinucleína, em C. elegans resultados DA neurônios na dose e idade-dependente neurodegeneração.
Worms expressar humana alfa-sinucleína em neurônios DA são isogênicos e expressar tanto GFP e humano alfa-sinucleína sob o promotor transportador DA (PDAt-1). A presença de GFP serve como um marcador facilmente visualizado por seguir neurodegeneração DA nesses animais. Inicialmente demonstrou que alfa-sinucleína neurodegeneração induzida DA poderia ser resgatado nestes animais por torsinA, uma proteína com atividade chaperone molecular 1. Além disso, o candidato relacionados com a DP genes identificados em nosso laboratório através de esforços em larga escala de triagem RNAi usando um ensaio misfolding alfa-sinucleína foram, então, sobre-expressa em C. elegans DA neurônios. Determinou-se que cinco dos sete genes testados representada moduladores candidato significativa de PD como eles resgatados alfa-sinucleína neurodegeneração induzida DA 2. Além disso, o Lab Lindquist (esta questão de Jove) realizou telas de fermento em que a alfa-sinucleína dependentes de toxicidade é usado como uma leitura de genes que podem aumentar ou suprimir citotoxicidade. Nós posteriormente examinou os genes candidatos fermento em nossa C. elegans ensaio neurodegeneração alfa-sinucleína induzida e validado com sucesso muitos destes três metas, 4.
Nossa metodologia envolve a geração de um elegans DA C. vetor de expressão neurônio-específicos usando a clonagem de cDNAs recombinational gene candidato sob o controle do PDAt-1 promotor. Estes plasmídeos são então microinjeção no tipo selvagem (N2) worms, juntamente com um marcador selecionável para transformação de sucesso. Múltiplas estáveis linhagens transgênicas de produzir a proteína nos neurônios DA candidato são obtidas de forma independente e depois cruzou para a cepa alfa-sinucleína degenerativas e avaliados quanto à neurodegeneração, tanto o animal eo nível de neurônio individual, ao longo do envelhecimento.
A perda idade-dependentes de neurônios de dopamina é um marco clínico da doença de Parkinson e tem sido associada com a acumulação ou misfolding de uma proteína chamada alfa-sinucleína. Aqui demonstramos como rótulo, através de um transgene fluorescente, a neurônios dopaminérgicos da C. elegans e imitar a neurodegeneração visto na doença de Parkinson por coexpressing humana alfa-sinucleína nestas células.
Este vídeo mostra a metodologia para a travessia de crescimento, genética, montagem e pontuação de …
Gostaríamos de agradecer o espírito cooperativo de todos os membros Caldwell Lab. Pesquisa distúrbios do movimento no laboratório tem sido apoiado pela distonia Bachmann-Strauss & Parkinson Foundation, Parkinson United Foundation, Parkinson Disease Association americana, doença de Parkinson Associação de Alabama, a Michael J. Fox Foundation for Research de Parkinson, e um de Iniciação Científica
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
Microscope Slides | Plain, 3×1″ | Fisher | 12-549 | |
Dissecting with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
Epifluorescent | Microscope | Nikon | Model E-800 | |
Filter Cube, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology |