Application d'une Assay C. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de Parkinson gènes
Summary
Cette vidéo montre comment utiliser C. elegans afin d'évaluer la neurodégénérescence neurone dopaminergique comme un modèle pour la maladie de Parkinson. Par ailleurs, cribles génétiques sont utilisés pour identifier les facteurs qui accentuent la dégénérescence ou sont neuroprotecteurs.
Abstract
Les améliorations apportées au diagnostic et au traitement de la maladie de Parkinson (MP) sont tributaires des connaissances sur les facteurs qui rendent la susceptibilité des populations à risque. Dans le processus de tenter d'identifier de nouveaux facteurs génétiques associés à la DP, les scientifiques ont généré de nombreuses listes de gènes candidats, les polymorphismes, et les protéines qui représentent des avancées importantes, mais ces pistes restent mécanistiquement indéfini. Notre travail vise vers un rétrécissement de manière significative ces listes en exploitant les avantages d'un système de modèle animal simple. Bien que les humains ont des milliards de neurones, le nématode Caenorhabditis elegans microscopiques a précisément 302, dont huit seulement de produire la dopamine (DA) dans hemaphrodites. Expression d'un gène humain codant pour la protéine PD-associé, l'alpha-synucléine, dans C. elegans résultats neurones DA de la dose et âge-dépendante neurodégénérescence.
Worms exprimer humaine alpha-synucléine dans les neurones DA sont isogéniques et d'exprimer à la fois la GFP et l'alpha-synucléine humaine sous le promoteur du transporteur DA (EPEC-1). La présence de la GFP sert de marqueur pour suivre facilement visualisés neurodégénérescence DA chez ces animaux. Nous avons d'abord démontré que l'alpha-synucléine neurodégénérescence induite DA ont pu être sauvés dans ces animaux par torsinA, une protéine à activité chaperon moléculaire 1. En outre, le candidat PD-liés gènes identifiés dans notre laboratoire au travers de grands efforts de dépistage ARNi en utilisant un dosage repliement alpha-synucléine ont ensuite été sur-exprimée dans les neurones DA C. elegans. Nous avons déterminé que cinq des sept gènes testés représenté modulateurs candidat significatif de PD comme ils sauvé l'alpha-synucléine induite DA neurodégénérescence 2. Par ailleurs, le laboratoire de Lindquist (cette question de Jupiter) a effectué la levure écrans où l'alpha-synucléine-dépendant toxicité est utilisée comme une lecture des gènes qui peuvent augmenter ou supprimer la cytotoxicité. Nous avons ensuite examiné les gènes candidats de la levure dans notre test de C. elegans neurodégénérescence alpha-synucléine-induite et validé avec succès plusieurs de ces trois cibles, 4.
Notre méthodologie implique la génération d'un vecteur d'expression de C. elegans DA neurone-spécifique en utilisant le clonage par recombinaison des gènes candidats ADNc sous le contrôle du promoteur EPEC-1. Ces plasmides sont ensuite microinjectés de type sauvage (N2) vers, avec un marqueur de sélection pour la transformation réussie. Plusieurs lignées transgéniques stables produisant la protéine candidate dans les neurones DA sont obtenus indépendamment et ensuite franchi dans la souche alpha-synucléine dégénératives et évalués pour la neurodégénérescence, à la fois l'animal et le niveau des neurones individuels, au cours du vieillissement.
Protocol
Discussion
La perte liée à l'âge des neurones à dopamine est une caractéristique clinique de la maladie de Parkinson et a été associée à l'accumulation ou mauvais repliement d'une protéine appelée alpha-synucléine. Ici, nous montrer comment l'étiquette, par l'intermédiaire d'un transgène fluorescentes, les neurones dopaminergiques de C. elegans et imiter la neurodégénérescence observée dans la maladie de Parkinson en coexprimant humaine alpha-synucléine dans ces cellules.
Cette vidéo illust…
Acknowledgements
Nous tenons à souligner l'esprit de coopération de tous les membres du laboratoire Caldwell. Mouvements anormaux de recherche dans le laboratoire a été soutenu par la dystonie Bachmann-Strauss & Parkinson Foundation, Royaume-Parkinson Foundation, American Association Maladie de Parkinson, la maladie de Parkinson Association de l'Alabama, la Fondation Michael J. Fox pour la recherche sur le Parkinson, et une recherche de premier cycle
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Microscope Slides | Plain, 3×1″ | Fisher | 12-549 | |
| Dissecting with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Epifluorescent | Microscope | Nikon | Model E-800 | |
| Filter Cube, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology |
References
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
- Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
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- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
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- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).
