Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.
Abstract
Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução. O método consiste na implantação de uma janela de imagem do crânio, a injeção de um corante indicador fluorescente de cálcio que podem ser tomadas por um grande número de neurônios e, finalmente, gravar a atividade dos neurônios com o tempo de imagem usando um lapso de cálcio in-vivo duas microscópio de fótons. Co-injeção de astrócitos específicos corantes permite diferenciar os neurônios de astrócitos. A técnica pode ser realizada em camundongos expressando moléculas fluorescentes em subpopulações específicas de neurônios para entender melhor as interações de rede de diferentes grupos de células.
Protocol
Prepare a solução indicador fluorescente de cálcio. Nós usamos corantes éster acetoxymethyl, ou AM corantes para breve. Estes são corantes que podem ser absorvidas pelas células quando injetado extracelularmente. Normalmente usamos Oregon-Green-BAPTA 01:00 ou 04:00 Fluo-a uma concentração de 1 mM. Corantes AM podem ser obtidas Invitrogen em frascos de 50 microgramas. Primeiro, preparar uma solução de 20% dos PLURONIC F-127 em DMSO. Nós aquecer a solução antes de usar todos os dias até a sua clara. Nós dissolver o indica…
Discussion
A vantagem deste método sobre gravações eletrofisiológicas é que é menos invasiva e permite que as gravações da atividade neuronal em densas redes neuronais. Ao fazer este procedimento é importante lembrar de tomar extremo cuidado ao realizar a craniotomia para não danificar a dura. Mesmo uma pequena quantidade de sangramento subdural com muito obscura a imagem.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer Olga Garaschuk para discussões úteis sobre como otimizar o carregamento a granel de indicadores de cálcio.