Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie.
Abstract
Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie. De methode bestaat uit het implanteren van een schedel imaging venster, het injecteren van een fluorescente calcium indicator kleurstof die kan worden genomen door een groot aantal neuronen en tenslotte het opnemen van de activiteit van neuronen met time-lapse calcium beeldvorming met behulp van een in-vivo twee foton microscoop. Co-injectie van astrocyten-specifieke kleurstoffen kunnen een onderscheid te maken neuronen van astrocyten. De techniek kan worden uitgevoerd in muizen die fluorescerende moleculen in specifieke subpopulaties van neuronen beter inzicht in de interactie met het netwerk van verschillende groepen van cellen.
Protocol
Bereid de fluorescerende calcium indicator oplossing. We maken gebruik van acetoxymethyl ester kleurstoffen, of AM-kleurstoffen voor kort. Dit zijn kleurstoffen die kunnen worden genomen door de cellen bij het extracellulair geïnjecteerd. Wij gebruiken meestal de Oregon-Green-BAPTA een AM-of Fluo-4 uur in een concentratie van 1 mM. AM kleurstoffen kunnen worden verkregen bij Invitrogen in 50 microgram flacons. We hebben eerst voor te bereiden een 20% oplossing van Pluronic F-127 in DMSO. We voorafgaande warm de oplossing om elke dag t…
Discussion
Het voordeel van deze methode meer dan elektrofysiologische opnames is dat het minder invasief en laat de opnames van de activiteit in dichte neuronale neuronale netwerken. Bij het doen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om uiterste zorg te nemen bij het uitvoeren van de craniotomie niet naar de dura schade. Zelfs een kleine hoeveelheid van de subdurale bloeden met een sterk obscure de beeldvorming.
Acknowledgements
We willen graag Olga Garaschuk erkennen voor nuttige discussies over het optimaliseren van de bulk van calcium indicatoren.