Настоящий протокол описывает перепрограммирование протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC) и нормальных эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Мы предлагаем оптимизированную и подробную, пошаговую процедуру, от подготовки лентивируса до создания стабильных линий ИПСК.
Генерация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием транскрипционных факторов была достигнута практически из любого типа дифференцированных клеток и оказалась очень ценной для исследований и клинического применения. Интересно, что ИПСК перепрограммирования раковых клеток, таких как протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), как было показано, обращает вспять инвазивный фенотип PDAC и переопределяет эпигеном рака. Дифференцировка ИПСК, полученных из PDAC, может повторить прогрессирование PDAC по сравнению с его ранним предшественником интраэпителиальной неоплазии поджелудочной железы (PanIN), выявляя молекулярные и клеточные изменения, которые происходят на ранних стадиях прогрессирования PDAC. Таким образом, ИПСК, полученные на основе PDAC, могут быть использованы для моделирования самых ранних стадий PDAC для выявления диагностических маркеров раннего обнаружения. Это особенно важно для пациентов с PDAC, которые обычно диагностируются на поздних метастатических стадиях из-за отсутствия надежных биомаркеров для более ранних стадий PanIN. Тем не менее, перепрограммирование линий раковых клеток, включая PDAC, в плюрипотентность остается сложным, трудоемким и сильно варьирующим между различными линиями. В данной статье мы опишем более последовательный протокол генерации ИПСК из различных клеточных линий PDAC человека с использованием лентивирусных векторов бицистроника. Полученные линии ИПСК стабильны и не зависят от экзогенной экспрессии перепрограммирующих факторов или индуцируемых препаратов. В целом, этот протокол способствует генерации широкого спектра ИПСК, полученных из PDAC, что имеет важное значение для обнаружения ранних биомаркеров, которые являются более специфичными и репрезентативными для случаев PDAC.
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из самых смертельных злокачественных новообразований, и ранняя диагностика остается сложной задачей из-за бессимптомного характера заболевания. У большинства пациентов с ОАПК диагноз ставится на поздней метастатической стадии, когда возможности лечения очень ограничены 1,2. В основном это связано с отсутствием надежных биомаркеров для ранних стадий, таких как те, которые могут быть легко обнаружены в виде белков, высвобождаемых в кровоток.
PDAC может распространяться очень рано во время его прогрессирования, и лучший прогноз связан с ранним выявлением рака, когда PDAC локализуется в поджелудочной железе3. Тем не менее, менее чем у десятой части пациентов с PDAC диагностируется благоприятный прогноз, позволяющий провести хирургическую резекцию. Тем не менее, те немногие, у которых есть операбельные опухоли, также склонны к рецидиву опухоли в течение 12месяцев.
За последние пятьдесят лет были достигнуты значительные улучшения в хирургических методах, уходе за пациентами и методах лечения 5,6. Тем не менее, 5-летняя выживаемость у пациентов с хирургически резецированным ППАК едва ли возросла до 17%. Тем не менее, это все еще лучше, чем у нерезецированных пациентов, которое осталось почти неизменным (0,9%)4,7. Химиотерапия является единственным альтернативным методом лечения PDAC. Тем не менее, этот вариант очень ограничен, так как подавляющее большинство пациентов с PDAC демонстрируют сильную резистентность к химиотерапевтическим препаратам, таким как гемцитабин 7,8. Другие препараты, такие как Эрлотиниб, доступны только для небольшой группы пациентов с PDAC со специфическими мутациями, большинство из которых демонстрируют резистентность к Эрлотинибу9. Неблагоприятные побочные эффекты, связанные с химиотерапией у большинства пациентов с PDAC, являются еще одним недостатком этого лечения10. В последнее время многообещающие стратегии показали, что ингибиторы контрольных точек иммунного ответа (ICI) и ингибиторы низкомолекулярных киназ (SMKI) могут быть эффективными в лечении PDAC, но устойчивый ответ на эти таргетные методы лечения остается ограниченным меньшинством пациентов11,12. В целом, открытие ранних биомаркеров, специфичных для PDAC, может проложить новые пути для ранней диагностики и лечения.
PDAC развивается из поражений-предшественников интраэпителиальных новообразований поджелудочной железы (PanIN), которые возникают в результате неинвазивной пролиферации эпителия протоков поджелудочной железы 13,14. В то время как образование PanIN инициируется онкогенными мутациями, такими как KRAS, для прогрессирования PDAC требуются дополнительные генетические и эпигенетические изменения. Было подсчитано, что прогрессирование PanIN через различные стадии в инвазивный PDAC занимает около 10 лет 13,15,16,17. Этот период времени дает прекрасную возможность извлечь выгоду из ранней диагностики PDAC. В связи с этим были проведены обширные исследования по созданию моделей опухолевого ксенотрансплантата на животных и органоидных культур для изучения прогрессирования PDAC 18,19,20,21. Эти модели были очень полезны для изучения инвазивных стадий PDAC, но не перехода от ранних фаз PanIN. Поэтому важно разработать экспериментальные модели, которые могут повторить раннюю прогрессию стадий PanIN, чтобы позволить обнаружить биомаркеры раннего обнаружения.
Перепрограммирование соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) с использованием четырех транскрипционных факторов OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC (OSKM) проиллюстрировало степень клеточной пластичности22. Пластичность раковых клеток была хорошо задокументирована, и перепрограммирование раковых клеток человека в ИПСК было успешно использовано для восстановления клеток до их первоначального клеточного состояния, устраняя многие эпигенетические повреждения, которые накапливались во время прогрессирования рака 23,24,25,26,27,28,29. Таким образом, возможность использования этой стратегии перепрограммирования для манипулирования идентификацией раковых клеток представляет большие перспективы в лечении рака30,31. Действительно, ранее мы показали, что дифференциация ИПСК, полученных из PDAC, может повторить прогрессирование PDAC до ранних стадий PanIN32. Путем идентификации генов и путей, специфичных для ранних и промежуточных стадий PDAC, были идентифицированы биомаркеры-кандидаты, которые могут быть клинически использованы для ранней диагностики PDAC32,33. Тем не менее, биомаркеры, обнаруженные с помощью одной линии ИПСК, показали ограниченный охват у большинства пациентов с PDAC32. Трудности с получением линий ИПСК от других пациентов с ОАПК остановили возможность обнаружения более надежных биомаркеров. Это связано со многими техническими факторами, в том числе с гетерогенностью доставки OSKM, так как только небольшая часть первичных клеток PDAC человека содержала все четыре фактора и успешно реагировала на перепрограммирование. Здесь представлен подробный протокол перепрограммирования первичных клеток PDAC с использованием более эффективной и последовательной двойной лентивирусной доставки OSKM.
Чтобы облегчить использование ИПСК для изучения прогрессирования рака, был разработан надежный протокол перепрограммирования раковых клеток поджелудочной железы. Перепрограммирование раковых клеток в плюрипотентность до сих пор оказалось очень сложной задачей, поскольку только в ?…
The authors have nothing to disclose.
А.С. и Дж.К. благодарят Cancer Research UK и OHSU за финансирование (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S получает награду MRC за развитие карьеры (MR/N024028/1). Программа A.A финансируется за счет стипендии доктора философии (стипендия 1078107040) от Города науки и технологий имени короля Абдул-Азиза. J.K финансируется грантом MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) и грантом Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Мы благодарим профессора Кэйсукэ Кадзи за любезное предоставление векторов перепрограммирования pSIN4-EF1a-O2S и pSIN4-CMV-K2M. В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Commons Attribution (CC BY) к любой версии рукописи, принятой автором, возникшей в результате этой заявки.
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
pMDG | AddGene | 187440 |
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
psPAX2 | AddGene | 12260 |
pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |