Reprogramação do Adenocarcinoma Ductal Pancreático para Pluripotência
Summary
O presente protocolo descreve a reprogramação do Adenocarcinoma Ductal Pancreático (ADP) e de células epiteliais ductais pancreáticas normais em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Fornecemos um procedimento otimizado e detalhado, passo a passo, desde a preparação do lentivírus até o estabelecimento de linhas iPSC estáveis.
Abstract
A geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando fatores de transcrição tem sido obtida a partir de quase qualquer tipo celular diferenciado e tem se mostrado altamente valiosa para pesquisas e aplicações clínicas. Curiosamente, a reprogramação iPSC de células cancerosas, como o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP), demonstrou reverter o fenótipo invasivo de ADP e anular o epigenoma do câncer. A diferenciação de iPSCs derivadas do PDAC pode recapitular a progressão do ADP a partir de seu precursor precoce da neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), revelando as mudanças moleculares e celulares que ocorrem precocemente durante a progressão do ADP. Portanto, iPSCs derivadas do PDAC podem ser usadas para modelar os estágios iniciais do PDAC para a descoberta de marcadores diagnósticos de detecção precoce. Isso é particularmente importante para pacientes com ADP, que geralmente são diagnosticados nos estágios metastáticos tardios devido à falta de biomarcadores confiáveis para os estágios iniciais da PanIN. No entanto, a reprogramação de linhagens de células cancerosas, incluindo PDAC, em pluripotência permanece desafiadora, trabalhosa e altamente variável entre diferentes linhagens. Aqui, descrevemos um protocolo mais consistente para gerar iPSCs a partir de várias linhagens celulares PDAC humanas usando vetores lentivirais bicistrônicos. As linhagens iPSC resultantes são estáveis, não mostrando dependência da expressão exógena de fatores reprogramadores ou drogas induzíveis. Em geral, esse protocolo facilita a geração de uma ampla gama de iPSCs derivadas do PDAC, o que é essencial para a descoberta precoce de biomarcadores mais específicos e representativos dos casos de ADP.
Introduction
O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma das neoplasias malignas mais fatais, e o diagnóstico precoce permanece desafiador devido à natureza assintomática da doença. A maioria dos pacientes com ADP é diagnosticada na fase metastática avançada, quando opções de tratamento muito limitadas estão disponíveis 1,2. Isso se deve principalmente à falta de biomarcadores confiáveis para os estágios iniciais, como aqueles que poderiam ser convenientemente detectados como proteínas liberadas na corrente sanguínea.
O ADP pode disseminar-se muito precocemente durante sua progressão, e um melhor prognóstico tem sido associado à detecção precoce do câncer quando o ADP está localizado no pâncreas3. Entretanto, menos de um décimo dos pacientes com ADP são diagnosticados com prognóstico favorável, permitindo a ressecção cirúrgica. No entanto, aqueles poucos com tumores ressecáveis também são propensos à recorrência tumoral em 12meses4.
Nas últimas cinco décadas, melhorias notáveis foram feitas nas técnicas cirúrgicas, no atendimento ao paciente e nas modalidades de tratamento 5,6. No entanto, a taxa de sobrevida em 5 anos em pacientes com ADP ressecados cirurgicamente mal subiu para 17%. No entanto, este ainda é melhor do que em pacientes não ressecados, que permaneceu praticamente inalterado (0,9%)4,7. A quimioterapia é a única outra alternativa de tratamento para o ADP. No entanto, essa opção é muito limitada, pois a grande maioria dos pacientes com ADP apresenta forte resistência a medicamentos quimioterápicos como a Gencitabina 7,8. Outros fármacos, como o erlotinibe, estão disponíveis apenas para um pequeno grupo de pacientes com ADP com mutações específicas, a maioria dos quais apresenta resistência ao erlotinibe9. Os efeitos adversos associados à quimioterapia na maioria dos pacientes com ADP são outra desvantagem desse tratamento10. Recentemente, estratégias promissoras têm mostrado que inibidores de checkpoints imunes (ICIs) e inibidores de pequenas moléculas quinases (SMKIs) podem ser eficazes no tratamento de ADP, mas respostas duráveis a essas terapias-alvo permanecem limitadas a uma minoria de pacientes11,12. Em geral, a descoberta de biomarcadores precoces específicos para o PDAC pode pavimentar novos caminhos para o diagnóstico e tratamento precoces.
O ADP desenvolve-se a partir de lesões precursoras de neoplasias intraepiteliais pancreáticas (PanIN) que resultam de proliferações epiteliais não invasivas dos ductos pancreáticos13,14. Enquanto a formação de PanIN é iniciada por mutações oncogênicas como KRAS, alterações genéticas e epigenéticas adicionais são necessárias para a progressão para PDAC. Projeta-se que a progressão da NIPan através dos diferentes estágios para ADP invasiva leva cerca de 10 anos 13,15,16,17. Esse período oferece uma grande oportunidade de se beneficiar do diagnóstico precoce de ADP. Portanto, extensas pesquisas têm sido realizadas para estabelecer modelos animais de xenoenxerto tumoral e culturas organoides para estudar a progressão do ADP18,19,20,21. Esses modelos têm sido muito úteis para estudar os estágios invasivos do ADP, embora não a transição das fases iniciais da PanIN. Portanto, é importante desenvolver modelos experimentais que possam recapitular a progressão precoce dos estágios de PanIN para permitir a descoberta de biomarcadores de detecção precoce.
A reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando os quatro fatores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC (OSKM) ilustrou a extensão da plasticidade celular22. A plasticidade das células cancerosas tem sido bem documentada, e a reprogramação de células cancerosas humanas em iPSCs tem sido usada com sucesso para redefinir as células ao seu estado celular original, removendo muitos dos insultos epigenéticos que se acumularam durante a progressão do câncer 23,24,25,26,27,28,29. A possibilidade de utilizar essa estratégia de reprogramação para manipular a identidade das células cancerígenas tem, portanto, se apresentado como grande promessa no tratamento docâncer30,31. De fato, mostramos anteriormente que a diferenciação de iPSCs derivadas de PDACs pode recapitular a progressão da PDAC através dos estágios iniciais da PanIN32. Por meio da identificação de genes e vias específicas para os estágios iniciais a intermediários da ADP, foram identificados biomarcadores candidatos que podem ser utilizados clinicamente para o diagnóstico precoce da ADP32,33. No entanto, os biomarcadores descobertos usando uma única linhagem iPSC mostraram cobertura limitada na maioria dos pacientes com ADP32. Os desafios de gerar linhas iPSC de outros pacientes com ADP interromperam a capacidade de descobrir biomarcadores mais confiáveis. Isso se deve a muitos fatores técnicos, incluindo a heterogeneidade da liberação de OSKM, já que apenas uma pequena porção de células PDAC primárias humanas continha todos os quatro fatores e respondia com sucesso à reprogramação. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para reprogramação de células PDAC primárias usando uma entrega lentiviral dupla mais eficiente e consistente de OSKM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para facilitar o uso da reprogramação iPSC para estudar a progressão do câncer, um protocolo robusto foi estabelecido para reprogramação de células de câncer de pâncreas. A reprogramação de células cancerosas em pluripotência tem se mostrado muito desafiadora até o momento, pois poucos estudos conseguiram gerar iPSCs a partir de células cancerosas32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 </s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S e J.K gostariam de agradecer à Cancer Research UK e à OHSU pelo financiamento (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A A.S é apoiada por um prêmio de desenvolvimento de carreira da MRC (MR/N024028/1). A.A é financiado por uma bolsa de doutorado (Bolsa ref. 1078107040) da Cidade Rei Abdulaziz para Ciência e Tecnologia. J.K é financiado pelo MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) e Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Agradecemos ao Prof. Keisuke Kaji por gentilmente fornecer o vetor de reprogramação pSIN4-EF1a-O2S e pSIN4-CMV-K2M. Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença Creative Commons Attribution (CC BY) a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
| pMDG | AddGene | 187440 |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
| psPAX2 | AddGene | 12260 |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
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