Het huidige protocol beschrijft de herprogrammering van ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) en normale ductale epitheelcellen van de pancreas tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s). We bieden een geoptimaliseerde en gedetailleerde, stapsgewijze procedure, van het bereiden van lentivirus tot het opzetten van stabiele iPSC-lijnen.
De generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) met behulp van transcriptiefactoren is bereikt uit bijna elk gedifferentieerd celtype en is zeer waardevol gebleken voor onderzoek en klinische toepassingen. Interessant is dat iPSC-herprogrammering van kankercellen, zoals ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC), is aangetoond dat het het invasieve PDAC-fenotype omkeert en het kankerepigenoom opheft. De differentiatie van PDAC-afgeleide iPSC’s kan PDAC-progressie recapituleren van de vroege voorloper van intra-epitheliale neoplasie (PanIN) van de pancreas, waardoor de moleculaire en cellulaire veranderingen worden onthuld die vroeg optreden tijdens PDAC-progressie. Daarom kunnen PDAC-afgeleide iPSC’s worden gebruikt om de vroegste stadia van PDAC te modelleren voor de ontdekking van diagnostische markers voor vroege detectie. Dit is vooral belangrijk voor PDAC-patiënten, die doorgaans worden gediagnosticeerd in de late metastatische stadia vanwege een gebrek aan betrouwbare biomarkers voor de eerdere PanIN-stadia. Het herprogrammeren van kankercellijnen, waaronder PDAC, in pluripotentie blijft echter een uitdaging, arbeidsintensief en zeer variabel tussen verschillende lijnen. Hier beschrijven we een consistenter protocol voor het genereren van iPSC’s uit verschillende menselijke PDAC-cellijnen met behulp van bicistronische lentivirale vectoren. De resulterende iPSC-lijnen zijn stabiel en vertonen geen afhankelijkheid van de exogene expressie van herprogrammerende factoren of induceerbare geneesmiddelen. Over het algemeen vergemakkelijkt dit protocol het genereren van een breed scala aan PDAC-afgeleide iPSC’s, wat essentieel is voor het ontdekken van vroege biomarkers die specifieker en representatiever zijn voor PDAC-gevallen.
Ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) is een van de meest fatale maligniteiten en een vroege diagnose blijft een uitdaging vanwege de asymptomatische aard van de ziekte. De meerderheid van de PDAC-patiënten wordt gediagnosticeerd in het gevorderde gemetastaseerde stadium wanneer zeer beperkte behandelingsopties beschikbaar zijn 1,2. Dit is voornamelijk te wijten aan het gebrek aan betrouwbare biomarkers voor de vroege stadia, zoals die welke gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd als eiwitten die in de bloedbaan vrijkomen.
PDAC kan zich zeer vroeg tijdens de progressie verspreiden en een betere prognose is in verband gebracht met vroege detectie van kanker wanneer PDAC is gelokaliseerd in de alvleesklier3. Minder dan een tiende van de PDAC-patiënten wordt echter gediagnosticeerd met een gunstige prognose, waardoor chirurgische resectie mogelijk is. Desalniettemin zijn die weinigen met resectabele tumoren ook vatbaar voor tumorrecidief binnen 12 maanden4.
In de afgelopen vijf decennia zijn opmerkelijke verbeteringen aangebracht in chirurgische technieken, patiëntenzorg en behandelingsmodaliteiten 5,6. De 5-jaarsoverleving bij chirurgisch verwijderde PDAC-patiënten is echter nauwelijks gestegen tot 17%. Dit is echter nog steeds beter dan dat bij niet-gereseceerde patiënten, dat vrijwel onveranderd is gebleven (0,9%)4,7. Chemotherapie is de enige andere alternatieve PDAC-behandeling. Toch is deze optie zeer beperkt, aangezien de overgrote meerderheid van de PDAC-patiënten een sterke resistentie vertoont tegen chemotherapiemedicijnen zoals Gemcitabine 7,8. Andere geneesmiddelen, zoals erlotinib, zijn alleen beschikbaar voor een kleine groep PDAC-patiënten met specifieke mutaties, van wie de meesten erlotinib-resistentie vertonen9. De nadelige bijwerkingen die gepaard gaan met chemotherapie bij de meeste PDAC-patiënten zijn nog een ander nadeel van dezebehandeling10. Onlangs hebben veelbelovende strategieën aangetoond dat immuuncheckpointremmers (ICI’s) en small molecule kinaseremmers (SMKI’s) effectief kunnen zijn bij de behandeling van PDAC, maar duurzame reacties op deze gerichte therapieën blijven beperkt tot een minderheid van de patiënten11,12. Over het algemeen kan de ontdekking van PDAC-specifieke vroege biomarkers nieuwe wegen effenen voor vroege diagnose en behandeling.
PDAC ontwikkelt zich uit voorloperlaesies van intra-epitheliale neoplasmata van de pancreas (PanIN) die het gevolg zijn van niet-invasieve proliferaties van het epitheel van de ductus pancreaticus13,14. Hoewel de vorming van PanIN wordt geïnitieerd door oncogenmutaties zoals KRAS, zijn aanvullende genetische en epigenetische veranderingen vereist voor de progressie naar PDAC. Er is voorspeld dat de progressie van PanIN door de verschillende stadia naar invasieve PDAC ongeveer 10 jaar duurt 13,15,16,17. Dit tijdsbestek biedt een geweldige kans om te profiteren van een vroege PDAC-diagnose. Daarom is er uitgebreid onderzoek gedaan om tumor-xenotransplantaatdiermodellen en organoïdeculturen vast te stellen om PDAC-progressie 18,19,20,21 te bestuderen. Deze modellen zijn zeer nuttig geweest voor het bestuderen van de invasieve stadia van PDAC, hoewel niet de overgang van de vroege PanIN-fasen. Het is daarom belangrijk om experimentele modellen te ontwikkelen die de vroege progressie van PanIN-stadia kunnen samenvatten om de ontdekking van biomarkers voor vroege detectie mogelijk te maken.
Het herprogrammeren van somatische cellen tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) met behulp van de vier transcriptiefactoren OCT4, SOX2, KLF4 en c-MYC (OSKM) heeft de mate van cellulaire plasticiteit geïllustreerd22. De plasticiteit van kankercellen is goed gedocumenteerd en het herprogrammeren van menselijke kankercellen in iPSC’s is met succes gebruikt om cellen terug te zetten naar hun oorspronkelijke cellulaire toestand, waardoor veel van de epigenetische beledigingen die zich tijdens de progressie van kanker hebben opgehoopt, zijn verwijderd 23,24,25,26,27,28,29. De mogelijkheid om deze herprogrammeringsstrategie te gebruiken om de identiteit van kankercellen te manipuleren, is daarom veelbelovend bij de behandeling van kanker30,31. We hebben inderdaad eerder aangetoond dat de differentiatie van iPSC’s afgeleid van PDAC’s de PDAC-progressie door de vroege PanIN-stadia kan recapituleren32. Door genen en routes te identificeren die specifiek zijn voor de vroege tot intermediaire stadia van PDAC, werden kandidaat-biomarkers geïdentificeerd die klinisch kunnen worden gebruikt voor vroege PDAC-diagnose32,33. De biomarkers die werden ontdekt met behulp van een enkele iPSC-lijn vertoonden echter een beperkte dekking bij de meerderheid van de PDAC-patiënten32. De uitdagingen van het genereren van iPSC-lijnen van andere PDAC-patiënten hebben het vermogen om betrouwbaardere biomarkers te ontdekken tot stilstand gebracht. Dit is te wijten aan vele technische factoren, waaronder de heterogeniteit van OSKM-afgifte, aangezien slechts een klein deel van de menselijke primaire PDAC-cellen alle vier de factoren bevatte en met succes reageerde op herprogrammering. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het herprogrammeren van primaire PDAC-cellen met behulp van een efficiëntere en consistentere dubbele lentivirale toediening van OSKM.
Om het gebruik van iPSC-herprogrammering voor het bestuderen van kankerprogressie te vergemakkelijken, is een robuust protocol opgesteld voor het herprogrammeren van alvleesklierkankercellen. Het herprogrammeren van kankercellen tot pluripotentie is tot nu toe een grote uitdaging gebleken, aangezien slechts enkele onderzoeken met succes iPSC’s hebben gegenereerd uit kankercellen 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46<sup…
The authors have nothing to disclose.
A.S en J.K willen Cancer Research UK en OHSU bedanken voor de financiering (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S wordt ondersteund door een MRC career development award (MR/N024028/1). AA wordt gefinancierd door een Ph.D. beurs (Scholarship ref. 1078107040) van King Abdulaziz City for Science and Technology. JK wordt gefinancierd door MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) en Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Wij danken Prof. Keisuke Kaji voor het beschikbaar stellen van de herprogrammeervector pSIN4-EF1a-O2S en pSIN4-CMV-K2M. Ten behoeve van open access heeft de auteur een Creative Commons Attribution (CC BY)-licentie toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortkomt uit deze inzending.
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
pMDG | AddGene | 187440 |
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
psPAX2 | AddGene | 12260 |
pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |