Riprogrammazione dell'adenocarcinoma duttale pancreatico alla pluripotenza
Summary
Il presente protocollo descrive la riprogrammazione dell’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) e delle cellule epiteliali duttali pancreatiche normali in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Forniamo una procedura ottimizzata e dettagliata, passo dopo passo, dalla preparazione dei lentivirus alla creazione di linee iPSC stabili.
Abstract
La generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando fattori di trascrizione è stata ottenuta da quasi tutti i tipi di cellule differenziate e si è dimostrata molto preziosa per la ricerca e le applicazioni cliniche. È interessante notare che la riprogrammazione iPSC delle cellule tumorali, come l’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), ha dimostrato di invertire il fenotipo PDAC invasivo e di ignorare l’epigenoma del cancro. La differenziazione delle iPSC derivate da PDAC può ricapitolare la progressione di PDAC dal suo precursore precoce della neoplasia intraepiteliale pancreatica (PanIN), rivelando i cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano precocemente durante la progressione di PDAC. Pertanto, le iPSC derivate da PDAC possono essere utilizzate per modellare le prime fasi di PDAC per la scoperta di marcatori diagnostici di diagnosi precoce. Ciò è particolarmente importante per i pazienti con PDAC, che in genere vengono diagnosticati nelle fasi metastatiche tardive a causa della mancanza di biomarcatori affidabili per le fasi iniziali di PanIN. Tuttavia, la riprogrammazione delle linee cellulari tumorali, incluso il PDAC, in pluripotenza rimane impegnativa, laboriosa e altamente variabile tra le diverse linee. Qui, descriviamo un protocollo più coerente per la generazione di iPSC da varie linee cellulari PDAC umane utilizzando vettori lentivirali bicistronici. Le linee di iPSC risultanti sono stabili e non mostrano alcuna dipendenza dall’espressione esogena di fattori di riprogrammazione o farmaci inducibili. Nel complesso, questo protocollo facilita la generazione di un’ampia gamma di iPSC derivate da PDAC, che è essenziale per scoprire biomarcatori precoci che sono più specifici e rappresentativi dei casi di PDAC.
Introduction
L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è una delle neoplasie maligne più fatali e la diagnosi precoce rimane difficile a causa della natura asintomatica della malattia. La maggior parte dei pazienti affetti da PDAC viene diagnosticata in fase metastatica avanzata, quando sono disponibili opzioni terapeutiche molto limitate 1,2. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di biomarcatori affidabili per le fasi iniziali, come quelli che potrebbero essere comodamente rilevati come proteine rilasciate nel flusso sanguigno.
Il PDAC può diffondersi molto presto durante la sua progressione e una prognosi migliore è stata collegata alla diagnosi precoce del cancro quando il PDAC è localizzato nel pancreas3. Tuttavia, a meno di un decimo dei pazienti con PDAC viene diagnosticata una prognosi favorevole, consentendo la resezione chirurgica. Tuttavia, i pochi con tumori resecabili sono anche inclini alla recidiva del tumore entro 12 mesi4.
Negli ultimi cinquant’anni sono stati apportati notevoli miglioramenti alle tecniche chirurgiche, alla cura del paziente e alle modalità di trattamento 5,6. Tuttavia, il tasso di sopravvivenza a 5 anni nei pazienti PDAC resecati chirurgicamente è salito a malapena al 17%. Ciononostante, questo dato è ancora migliore di quello dei pazienti non resecati, che è rimasto pressoché invariato (0,9%)4,7. La chemioterapia è l’unico altro trattamento alternativo per la PDAC. Tuttavia, questa opzione è molto limitata in quanto la grande maggioranza dei pazienti con PDAC mostra una forte resistenza ai farmaci chemioterapici come la gemcitabina 7,8. Altri farmaci, come l’erlotinib, sono disponibili solo per un piccolo gruppo di pazienti affetti da PDAC con mutazioni specifiche, la maggior parte dei quali mostra resistenza all’erlotinib9. Gli effetti collaterali avversi associati alla chemioterapia nella maggior parte dei pazienti con PDAC sono un altro svantaggio di questo trattamento10. Recentemente, strategie promettenti hanno dimostrato che gli inibitori del checkpoint immunitario (ICI) e gli inibitori delle chinasi a piccole molecole (SMKI) possono essere efficaci nel trattamento del PDAC, ma le risposte durature a queste terapie mirate rimangono limitate a una minoranza di pazienti11,12. Nel complesso, la scoperta di biomarcatori precoci specifici per PDAC può aprire nuove strade per la diagnosi e il trattamento precoci.
La PDAC si sviluppa da lesioni precursori delle neoplasie intraepiteliali pancreatiche (PanIN) che derivano da proliferazioni epiteliali del dotto pancreatico non invasive13,14. Mentre la formazione di PanIN è iniziata da mutazioni oncogeniche come KRAS, sono necessarie ulteriori alterazioni genetiche ed epigenetiche per la progressione verso PDAC. È stato previsto che la progressione di PanIN attraverso i diversi stadi in PDAC invasivo richieda circa 10 anni 13,15,16,17. Questo lasso di tempo offre una grande opportunità per trarre vantaggio dalla diagnosi precoce del PDAC. Pertanto, sono state condotte ricerche approfondite per stabilire modelli animali di xenotrapianto tumorale e colture di organoidi per studiare la progressionedel PDAC 18,19,20,21. Questi modelli sono stati molto utili per studiare gli stadi invasivi del PDAC, anche se non la transizione dalle prime fasi di PanIN. È quindi importante sviluppare modelli sperimentali in grado di ricapitolare la progressione precoce degli stadi di PanIN per consentire la scoperta di biomarcatori di diagnosi precoce.
La riprogrammazione delle cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando i quattro fattori di trascrizione OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC (OSKM) ha illustrato l’estensione della plasticità cellulare22. La plasticità delle cellule tumorali è stata ben documentata e la riprogrammazione delle cellule tumorali umane in iPSC è stata utilizzata con successo per riportare le cellule al loro stato cellulare originale, rimuovendo molti degli insulti epigenetici che si sono accumulati durante la progressione del cancro 23,24,25,26,27,28,29. La possibilità di utilizzare questa strategia di riprogrammazione per manipolare l’identità delle cellule tumorali ha, quindi, presentato una grande promessa nel trattamento del cancro30,31. Infatti, abbiamo precedentemente dimostrato che la differenziazione delle iPSC derivate dai PDAC può ricapitolare la progressione del PDAC attraverso i primi stadi PanIN32. Identificando i geni e i percorsi specifici per gli stadi preco-intermedi del PDAC, sono stati identificati biomarcatori candidati che possono essere utilizzati clinicamente per la diagnosi precoce del PDAC32,33. Tuttavia, i biomarcatori scoperti utilizzando una singola linea di iPSC hanno mostrato una copertura limitata nella maggior parte dei pazienti con PDAC32. Le sfide legate alla generazione di linee di iPSC da altri pazienti affetti da PDAC hanno interrotto la capacità di scoprire biomarcatori più affidabili. Ciò è dovuto a molti fattori tecnici, tra cui l’eterogeneità della somministrazione di OSKM, poiché solo una piccola porzione di cellule PDAC primarie umane conteneva tutti e quattro i fattori e rispondeva con successo alla riprogrammazione. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per la riprogrammazione delle cellule PDAC primarie utilizzando una doppia somministrazione lentivirale più efficiente e coerente di OSKM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per facilitare l’uso della riprogrammazione delle iPSC per lo studio della progressione del cancro, è stato stabilito un robusto protocollo per la riprogrammazione delle cellule tumorali del pancreas. La riprogrammazione delle cellule tumorali in pluripotenza si è dimostrata finora molto impegnativa, poiché solo pochi studi hanno generato con successo iPSC da cellule tumorali 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S e J.K desiderano ringraziare Cancer Research UK e OHSU per il finanziamento (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S è supportato da un premio per lo sviluppo della carriera MRC (MR/N024028/1). A.A è finanziato da una borsa di dottorato di ricerca (Scholarship ref. 1078107040) della King Abdulaziz City for Science and Technology. J.K è finanziato da MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) e Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Ringraziamo il Prof. Keisuke Kaji per averci gentilmente fornito il vettore di riprogrammazione pSIN4-EF1a-O2S e pSIN4-CMV-K2M. Ai fini dell’accesso aperto, l’autore ha applicato una licenza Creative Commons Attribution (CC BY) a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall’autore derivante da questa presentazione.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
| pMDG | AddGene | 187440 |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
| psPAX2 | AddGene | 12260 |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
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