Мы предоставляем всесторонний обзор и уточнение существующих протоколов формирования органоидов гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), охватывающих все этапы культивирования органоидов. Эта система служит ценной моделью для идентификации потенциальных терапевтических мишеней и оценки эффективности препаратов-кандидатов.
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является широко распространенной и смертельной опухолью во всем мире, и ее позднее обнаружение и отсутствие эффективных специфических терапевтических агентов требуют дальнейших исследований ее патогенеза и лечения. Органоиды, новая модель, которая очень похожа на нативную опухолевую ткань и может быть культивирована in vitro, вызвали значительный интерес в последние годы, с многочисленными сообщениями о разработке органоидных моделей для рака печени. В этом исследовании мы успешно оптимизировали процедуру и разработали протокол культивирования, который позволяет формировать органоиды ГЦК более крупного размера со стабильными условиями пассажа и культивирования. В этой статье мы подробно описали каждый этап процедуры, охватывая весь процесс диссоциации тканей ГЦК, органоидного покрытия, культивирования, пассажа, криоконсервации и реанимации, а также подробно описали меры предосторожности. Эти органоиды демонстрируют генетическое сходство с исходными тканями ГЦК и могут быть использованы для различных применений, включая идентификацию потенциальных терапевтических мишеней для опухолей и последующую разработку лекарств.
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), широко распространенная и широко разнообразная опухоль1, привлекла значительное внимание в медицинском сообществе. Наличие линейной пластичности и существенной гетерогенности в ГЦК позволяет предположить, что опухолевые клетки, происходящие от разных пациентов, и даже различные поражения у одного и того же пациента могут проявлять несхожие молекулярные и фенотипические признаки, тем самым создавая огромные препятствия для продвижения инновационных терапевтических подходов 2,3,4,5 . Следовательно, существует настоятельная необходимость в более глубоком понимании биологических свойств и механизмов лекарственной устойчивости при ГЦК для разработки более эффективных стратегий лечения.
В последние десятилетия исследователи посвятили свои усилия разработке моделей in vitro с целью изучения ГЦК 3,4. Несмотря на некоторые достижения, ограничения сохраняются. Эти модели охватывают целый ряд методов, таких как использование клеточных линий, первичных клеток и ксенотрансплантатов, полученных от пациента (PDX). Клеточные линии служат моделями in vitro для долгосрочного культивирования опухолевых клеток, полученных от пациентов с ГЦК, предлагая преимущества удобства и легкого расширения. Модели первичных клеток предполагают прямое выделение и культивирование первичных опухолевых клеток из опухолевых тканей пациента, тем самым обеспечивая представление биологических характеристик, которые очень похожи на характеристики самих пациентов. PDX-модели предполагают трансплантацию опухолевых тканей пациента мышам с целью более точного моделирования роста опухоли и ответной реакции. Эти модели сыграли важную роль в исследованиях ГЦК, но они обладают определенными ограничениями, включая гетерогенность клеточных линий и неспособность полностью реплицироваться в условиях in vivo. Кроме того, длительное культивирование in vitro может привести к ухудшению исходных характеристик и функциональности клеток, что создает проблемы с точным представлением биологических свойств ГЦК. Кроме того, использование моделей PDX отнимает много времени и средств3.
Для устранения этих ограничений и более точного воспроизведения физиологических свойств ГЦК было введено использование органоидной технологии в качестве перспективной исследовательской платформы, способной превзойти предыдущие ограничения. Органоиды, которые представляют собой трехмерные клеточные модели, культивируемые in vitro, обладают способностью воспроизводить структуру и функциональность реальных органов. Тем не менее, в контексте ГЦК существуют определенные проблемы в создании органоидных моделей. Эти проблемы включают в себя недостаточно подробное описание процедур конструирования органоидов ГЦК, отсутствие всеобъемлющих протоколов для всего процесса конструирования органоидов ГЦК и, как правило, небольшой размер культивируемых органоидов 6,7,8. В свете обычно ограниченных размеров культивируемых органоидов мы попытались решить эти проблемы путем разработки всеобъемлющего протокола, охватывающего всю конструкцию органоида ГЦК6. Этот протокол включает в себя диссоциацию тканей, органоидное покрытие, культивирование, пассаж, криоконсервацию и реанимацию. Оптимизировав технологические этапы и уточнив состав питательной среды, мы успешно создали модели органоидов ГЦК, способные к устойчивому росту и длительному пассажу 6,8. В последующих разделах будет представлен всесторонний отчет об эксплуатационных тонкостях и соответствующих факторах, участвующих в построении органоидов ГЦК.
Одним из заметных преимуществ органоидных моделей, полученных от пациентов, является их способность точно воспроизводить биологические характеристики опухолей, охватывая структуру тканей и геномный ландшафт. Эти модели демонстрируют выдающийся уровень точности и эффективно отража?…
The authors have nothing to disclose.
Исследование выполнено при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82122048; 82003773; 82203380) и Фонда фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований провинции Гуандун (2023A1515011416).
[Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
DAPT | Merck | D5942 | |
Dexamethasone | Merck | D4902 | |
DMSO | Merck | C6164 | |
DNaseI | Merck | DN25 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
Forceps | N/A | N/A | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
Nicotinamide | Merck | N0636 | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
Surgical scissors | N/A | N/A | |
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
TNFα | Peprotech | 315-01A | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |