당사는 오가노이드 배양의 모든 단계를 포괄하는 간세포 암종(HCC) 오가노이드 형성에 대한 기존 프로토콜에 대한 포괄적인 개요와 개선을 제공합니다. 이 시스템은 잠재적인 치료 표적을 식별하고 약물 후보 물질의 효과를 평가하는 데 유용한 모델 역할을 합니다.
간세포 암종(HCC)은 전 세계적으로 매우 유병률이 높고 치명적인 종양이며, 늦은 발견과 효과적인 특이적 치료제의 부족으로 인해 발병 기전 및 치료에 대한 추가 연구가 필요합니다. 오가노이드는 천연 종양 조직과 매우 유사하며 체외에서 배양할 수 있는 새로운 모델로, 최근 몇 년 동안 간암에 대한 오가노이드 모델 개발에 대한 수많은 보고와 함께 상당한 관심을 받고 있습니다. 이 연구에서는 절차를 성공적으로 최적화하고 안정적인 패시에이징 및 배양 조건을 가진 더 큰 크기의 간세포암 오가노이드를 형성할 수 있는 배양 프로토콜을 확립했습니다. 간세포암 조직 해리, 오가노이드 도금, 배양, 패로징, 동결 보존 및 소생술의 전체 과정을 포괄하는 절차의 각 단계를 포괄적으로 설명했으며 이 논문에서 자세한 예방 조치를 제공했습니다. 이러한 오가노이드는 원래 간세포암 조직과 유전적 유사성을 나타내며 종양에 대한 잠재적 치료 표적 식별 및 후속 약물 개발을 포함한 다양한 응용 분야에 활용될 수 있습니다.
간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 널리 퍼져 있고 매우 다양한 종양1으로, 의학계에서 상당한 주목을 받고 있다. 간세포암에서 계통 가소성과 상당한 이질성의 존재는 다양한 환자에서 유래한 종양 세포와 동일한 환자 내의 뚜렷한 병변이 서로 다른 분자 및 표현형 형질을 나타낼 수 있음을 시사하며, 따라서 혁신적인 치료 접근법의 발전에 만만치 않은 장애물을 제시할 수 있습니다 2,3,4,5 . 결과적으로, 보다 효과적인 치료 전략의 공식화에 정보를 제공하기 위해 간세포암에서 약물 내성의 생물학적 특성과 메커니즘에 대한 이해를 높일 필요가 있습니다.
최근 수십 년 동안 연구자들은 HCC 3,4를 연구하기 위한 목적으로 체외 모델 개발에 전념해 왔습니다. 일부 발전에도 불구하고 한계는 여전히 남아 있습니다. 이러한 모델에는 세포주, 일차 세포 및 환자 유래 이종이식(PDX)의 활용과 같은 다양한 기술이 포함됩니다. 세포주는 간세포암 환자로부터 얻은 종양 세포의 장기 배양을 위한 in vitro 모델 역할을 하며, 편의성과 손쉬운 확장의 이점을 제공합니다. 일차 세포 모델은 환자 종양 조직에서 원발성 종양 세포를 직접 분리하고 배양하여 환자 자신과 매우 유사한 생물학적 특성을 나타냅니다. PDX 모델은 종양의 성장과 반응을 보다 충실하게 시뮬레이션하기 위해 환자의 종양 조직을 마우스에 이식하는 것을 수반합니다. 이러한 모델은 간세포암 연구에서 중요한 역할을 해왔지만, 세포주의 이질성과 in vivo 조건에서 완전히 복제할 수 없다는 등 특정 한계가 있습니다. 또한, 체외 배양이 장기화되면 세포 본래의 특성과 기능이 저하되어 간세포암의 생물학적 특성을 정확하게 표현하는 데 어려움이 있을 수 있습니다. 또한 PDX 모델을 활용하려면 시간과 비용이 많이 듭니다3.
이러한 한계를 극복하고 간세포암의 생리학적 특성을 보다 정확하게 재현하기 위해 오가노이드 기술의 활용은 이전의 제약을 뛰어넘을 수 있는 유망한 연구 플랫폼으로 도입되었습니다. 체외에서 배양된 3차원 세포 모델인 오가노이드는 실제 장기의 구조와 기능을 복제할 수 있습니다. 그러나 HCC의 맥락에서 오가노이드 모델을 확립하는 데에는 몇 가지 문제가 있습니다. 이러한 문제에는 간세포암 오가노이드 구성 절차에 대한 불충분한 설명, 간세포형 오가노이드 구성의 전체 프로세스에 대한 포괄적인 프로토콜의 부족, 일반적으로 배양된 오가노이드의 크기가 작다는 점등이 포함됩니다 6,7,8. 배양된 오가노이드의 일반적으로 제한된 차원에 비추어 우리는 HCC 오가노이드 구성 전체를 포괄하는 포괄적인 프로토콜의 개발을 통해 이러한 문제를 해결하기 위해 노력했습니다6. 이 프로토콜에는 조직 해리, 오가노이드 도금, 배양, 패시징, 동결 보존 및 소생이 포함됩니다. 절차적 단계를 최적화하고 배양 배지의 조성을 개선함으로써 지속적인 성장과 장기적인 통과가 가능한 HCC 오가노이드 모델을 성공적으로 확립했습니다 6,8. 다음 섹션에서는 간세포암 오가노이드의 구성과 관련된 운영상의 복잡성 및 관련 요인에 대한 포괄적인 설명이 제시됩니다.
환자 유래 오가노이드 모델의 주목할 만한 이점 중 하나는 조직 구조와 게놈 지형을 포괄하는 종양의 생물학적 특성을 충실하게 복제할 수 있다는 것입니다. 이러한 모델은 놀라운 수준의 정확도를 보여주며 장기간 배양 기간에도 종양의 이질성과 진행을 효과적으로 반영합니다 6,8,9. 이 정교한 오가노이드 배양 프로토콜의 ?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82122048; 82003773; 82203380)과 광둥 기초 및 응용 기초 연구 재단 (2023A1515011416)의 지원을 받았습니다.
[Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
DAPT | Merck | D5942 | |
Dexamethasone | Merck | D4902 | |
DMSO | Merck | C6164 | |
DNaseI | Merck | DN25 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
Forceps | N/A | N/A | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
Nicotinamide | Merck | N0636 | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
Surgical scissors | N/A | N/A | |
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
TNFα | Peprotech | 315-01A | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |