Nous fournissons une vue d’ensemble complète et affinons les protocoles existants pour la formation d’organoïdes du carcinome hépatocellulaire (CHC), englobant toutes les étapes de la culture des organoïdes. Ce système sert de modèle précieux pour l’identification de cibles thérapeutiques potentielles et l’évaluation de l’efficacité des candidats-médicaments.
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une tumeur très répandue et mortelle dans le monde entier et sa découverte tardive et l’absence d’agents thérapeutiques spécifiques efficaces nécessitent des recherches supplémentaires sur sa pathogenèse et son traitement. Les organoïdes, un nouveau modèle qui ressemble beaucoup au tissu tumoral natif et qui peut être cultivé in vitro, ont suscité un intérêt considérable ces dernières années, avec de nombreux rapports sur le développement de modèles organoïdes pour le cancer du foie. Dans cette étude, nous avons réussi à optimiser la procédure et à établir un protocole de culture qui permet la formation d’organoïdes de CHC de plus grande taille avec des conditions de passage et de culture stables. Nous avons décrit de manière exhaustive chaque étape de la procédure, couvrant l’ensemble du processus de dissociation des tissus CHC, de placage d’organoïdes, de culture, de passage, de cryoconservation et de réanimation, et fourni des précautions détaillées dans cet article. Ces organoïdes présentent une similitude génétique avec les tissus CHC d’origine et peuvent être utilisés pour diverses applications, y compris l’identification de cibles thérapeutiques potentielles pour les tumeurs et le développement ultérieur de médicaments.
Le carcinome hépatocellulaire (CHC), une tumeur1 répandue et très diversifiée, a suscité une attention considérable au sein de la communauté médicale. La présence d’une plasticité de lignée et d’une hétérogénéité substantielle dans le CHC suggère que les cellules tumorales provenant de différents patients et même de lésions distinctes chez le même patient peuvent présenter des traits moléculaires et phénotypiques dissemblables, présentant ainsi des obstacles redoutables à l’avancement d’approches thérapeutiques innovantes 2,3,4,5 . Par conséquent, il est impératif de mieux comprendre les caractéristiques biologiques et les mécanismes de la résistance aux médicaments dans le CHC afin d’éclairer la formulation de stratégies de traitement plus efficaces.
Au cours des dernières décennies, les chercheurs ont consacré leurs efforts au développement de modèles in vitro dans le but d’étudier le CHC 3,4. Malgré certaines avancées, des limites persistent. Ces modèles englobent une gamme de techniques, telles que l’utilisation de lignées cellulaires, de cellules primaires et de xénogreffes dérivées de patients (PDX). Les lignées cellulaires servent de modèles in vitro pour la culture à long terme de cellules tumorales obtenues à partir de patients atteints de CHC, offrant les avantages de la commodité et de la facilité d’expansion. Les modèles cellulaires primaires impliquent l’isolement direct et la culture de cellules tumorales primaires à partir de tissus tumoraux de patients, fournissant ainsi une représentation des caractéristiques biologiques qui ressemblent beaucoup à celles des patients eux-mêmes. Les modèles PDX impliquent la transplantation de tissus tumoraux de patients chez la souris, dans le but de simuler plus fidèlement la croissance et la réponse tumorales. Ces modèles ont joué un rôle déterminant dans la recherche sur le CHC, mais ils présentent certaines limites, notamment l’hétérogénéité des lignées cellulaires et l’incapacité de se répliquer complètement dans des conditions in vivo. De plus, une culture in vitro prolongée peut entraîner une détérioration des caractéristiques et des fonctionnalités d’origine des cellules, ce qui pose des problèmes pour représenter avec précision les propriétés biologiques du CHC. De plus, l’utilisation des modèles PDX est à la fois longue et coûteuse3.
Pour remédier à ces limites et reproduire plus précisément les attributs physiologiques du CHC, l’utilisation de la technologie des organoïdes a été introduite comme une plate-forme de recherche prometteuse capable de dépasser les contraintes précédentes. Les organoïdes, qui sont des modèles cellulaires tridimensionnels cultivés in vitro, ont la capacité de reproduire la structure et la fonctionnalité d’organes réels. Cependant, dans le contexte du CHC, il existe certains défis dans l’établissement de modèles organoïdes. Ces défis comprennent des descriptions insuffisamment détaillées des procédures de construction des organoïdes CHC, l’absence de protocoles complets pour l’ensemble du processus de construction des organoïdes CHC et la petite taille typique des organoïdes cultivés 6,7,8. À la lumière des dimensions généralement limitées des organoïdes cultivés, nous nous sommes efforcés de relever ces défis par le développement d’un protocole complet englobant l’ensemble de la construction des organoïdes CHC6. Ce protocole englobe la dissociation tissulaire, le placage d’organoïdes, la culture, le passage, la cryoconservation et la réanimation. En optimisant les étapes procédurales et en affinant la composition du milieu de culture, nous avons réussi à établir des modèles organoïdes de CHC capables d’une croissance soutenue et d’un passage à long terme 6,8. Dans les sections suivantes, un compte rendu complet des subtilités opérationnelles et des facteurs pertinents impliqués dans la construction des organoïdes HCC sera présenté.
L’un des avantages notables des modèles organoïdes dérivés des patients réside dans leur capacité à reproduire fidèlement les caractéristiques biologiques des tumeurs, englobant la structure tissulaire et le paysage génomique. Ces modèles font preuve d’un niveau de précision remarquable et reflètent efficacement l’hétérogénéité et la progression des tumeurs, même sur de longues périodes de culture 6,8,9…
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82122048 ; 82003773 ; 82203380) et la Fondation de recherche fondamentale et appliquée du Guangdong (2023A1515011416).
[Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
DAPT | Merck | D5942 | |
Dexamethasone | Merck | D4902 | |
DMSO | Merck | C6164 | |
DNaseI | Merck | DN25 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
Forceps | N/A | N/A | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
Nicotinamide | Merck | N0636 | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
Surgical scissors | N/A | N/A | |
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
TNFα | Peprotech | 315-01A | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |