Fornecemos uma visão abrangente e refinamento dos protocolos existentes para a formação de organoides de carcinoma hepatocelular (CHC), abrangendo todas as etapas do cultivo de organoides. Esse sistema serve como um modelo valioso para a identificação de potenciais alvos terapêuticos e a avaliação da efetividade de candidatos a fármacos.
O carcinoma hepatocelular (CHC) é um tumor altamente prevalente e letal em todo o mundo e sua descoberta tardia e a falta de agentes terapêuticos específicos eficazes requerem mais pesquisas sobre sua patogênese e tratamento. Os organoides, um novo modelo que se assemelha muito ao tecido tumoral nativo e pode ser cultivado in vitro, têm despertado interesse significativo nos últimos anos, com numerosos relatos sobre o desenvolvimento de modelos organoides para câncer de fígado. Neste estudo, otimizamos com sucesso o procedimento e estabelecemos um protocolo de cultura que permite a formação de organoides de CHC de maior tamanho com condições estáveis de passagem e cultura. Descrevemos de forma abrangente cada etapa do procedimento, cobrindo todo o processo de dissociação tecidual do CHC, plaqueamento organoide, cultura, passagem, criopreservação e ressuscitação, e fornecemos precauções detalhadas neste artigo. Esses organoides exibem similaridade genética com os tecidos originais do CHC e podem ser utilizados para diversas aplicações, incluindo a identificação de potenciais alvos terapêuticos para tumores e subsequente desenvolvimento de drogas.
O carcinoma hepatocelular (CHC), um tumor prevalente e extensamentediverso1, tem recebido considerável atenção na comunidade médica. A presença de plasticidade de linhagem e heterogeneidade substancial no CHC sugere que células tumorais originadas de vários pacientes e mesmo lesões distintas dentro de um mesmo paciente podem manifestar características moleculares e fenotípicas diferentes, apresentando obstáculos formidáveis no avanço de abordagens terapêuticas inovadoras2,3,4,5. Consequentemente, é imperiosa a necessidade de maior compreensão dos atributos biológicos e mecanismos de resistência às drogas no CHC para subsidiar a formulação de estratégias de tratamento mais eficazes.
Nas últimas décadas, pesquisadores têm dedicado seus esforços ao desenvolvimento de modelos in vitro com a finalidade de estudar o CHC 3,4. Apesar de alguns avanços, as limitações persistem. Esses modelos englobam uma variedade de técnicas, como a utilização de linhagens celulares, células primárias e xenoenxertos derivados do paciente (PDX). As linhagens celulares servem como modelos in vitro para cultura a longo prazo de células tumorais obtidas de pacientes com CHC, oferecendo os benefícios de conveniência e fácil expansão. Os modelos celulares primários envolvem o isolamento direto e o cultivo de células tumorais primárias de tecidos tumorais dos pacientes, fornecendo assim uma representação de características biológicas que se assemelham muito às dos próprios pacientes. Os modelos PDX envolvem o transplante de tecidos tumorais de pacientes em camundongos, com o objetivo de simular mais fielmente o crescimento e a resposta tumoral. Esses modelos têm sido fundamentais na pesquisa do CHC, mas possuem certas limitações, incluindo a heterogeneidade das linhagens celulares e a incapacidade de replicar totalmente as condições in vivo. Além disso, o cultivo in vitro prolongado pode resultar na deterioração das características e funcionalidades originais das células, colocando desafios na representação precisa das propriedades biológicas do CHC. Além disso, a utilização de modelos PDX é demorada e dispendiosa3.
Para abordar essas limitações e replicar com mais precisão os atributos fisiológicos do CHC, a utilização da tecnologia organoide tem sido introduzida como uma plataforma de pesquisa promissora capaz de superar restrições anteriores. Os organoides, que são modelos celulares tridimensionais cultivados in vitro, têm a capacidade de replicar a estrutura e a funcionalidade de órgãos reais. No entanto, no contexto do CHC, existem alguns desafios no estabelecimento de modelos organoides. Esses desafios incluem descrições insuficientemente detalhadas dos procedimentos de construção de organoides de CHC, falta de protocolos abrangentes para todo o processo de construção de organoides de CHC e o tamanho tipicamente pequeno de organoides cultivados 6,7,8. À luz das dimensões tipicamente limitadas dos organoides cultivados, nós nos esforçamos para enfrentar esses desafios através do desenvolvimento de um protocolo abrangente abrangendo a totalidade da construção de organoides de CHC6. Esse protocolo engloba dissociação tecidual, plaqueamento organoide, cultura, passaging, criopreservação e ressuscitação. Otimizando as etapas do procedimento e refinando a composição do meio de cultura, estabelecemos com sucesso modelos organoides de CHC capazes de crescimento sustentado e passaging a longo prazo 6,8. Nas seções subsequentes, um relato abrangente dos meandros operacionais e fatores pertinentes envolvidos na construção de organoides de CHC será apresentado.
Um benefício notável dos modelos organoides derivados do paciente reside em sua capacidade de replicar fielmente as características biológicas dos tumores, abrangendo a estrutura do tecido e a paisagem genômica. Esses modelos demonstram um notável nível de acurácia e refletem efetivamente a heterogeneidade e a progressão dos tumores, mesmo durante longos períodos decultivo6,8,9. Através da utilização deste refinado …
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82122048; 82003773; 82203380) e pela Fundação de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangdong (2023A1515011416).
[Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
DAPT | Merck | D5942 | |
Dexamethasone | Merck | D4902 | |
DMSO | Merck | C6164 | |
DNaseI | Merck | DN25 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
Forceps | N/A | N/A | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
Nicotinamide | Merck | N0636 | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
Surgical scissors | N/A | N/A | |
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
TNFα | Peprotech | 315-01A | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |