Melhorando a confiabilidade do biobanco de tumores de próstata com técnica de amostragem aprimorada e caracterização histológica

Summary

Este protocolo descreve um método para facilitar a coleta de amostras de espécimes de prostatectomia radical. O objetivo é mapear, caracterizar e dissecar micro-macro amostras de tecido dos espécimes com base em critérios anatomopatológicos antes de armazená-los em um Biobanco.

Abstract

A aquisição de amostras de tecido tumoral frescas e bem caracterizadas é fundamental para a realização de estudos “ômicos” de alta qualidade. No entanto, pode ser particularmente desafiador no contexto do câncer de próstata (CP) devido à natureza única desse órgão e à alta heterogeneidade associada a esse tumor. Por outro lado, caracterizar histopatologicamente as amostras antes de seu armazenamento sem causar alterações teciduais significativas também é um desafio intrigante. Nesse contexto, apresentamos um novo método para aquisição, mapeamento, caracterização e microdissecação de tecido prostático ressecado com base em critérios anatomopatológicos.

Ao contrário dos protocolos publicados anteriormente, este método reduz o tempo necessário para a análise histopatológica da peça de próstata sem comprometer sua estrutura, o que é crucial para a avaliação das margens cirúrgicas. Além disso, permite o delineamento e micro-macro dissecção de amostras frescas de tecido prostático, com foco em áreas histológicas de tumores definidas por critérios patológicos como escore de Gleason, lesões precursoras (neoplasia intraepitelial prostática de alto grau – NIP) e lesões inflamatórias (prostatite). Essas amostras são então armazenadas em um Biobanco para análises de pesquisa subsequentes.

Introduction

O câncer de próstata (CP) é o^2º câncer mais frequente em homens e a^5ª principal causa de morte em todo o mundo¹. O tratamento e o prognóstico do paciente dependem do estadiamento e da classificação (escore de Gleason) do tumor, como evidenciado pelas maiores taxas de sobrevida em 5 anos de tumores localizados e de baixo grau (grau 6 de Gleason) (99%) em comparação com altos graus de Gleason e tumores metastáticos (31%)².

A recidiva local do PC e a falha do tratamento têm sido associadas à alta heterogeneidade genética intratumoral característica desse tipo^{de tumor 3}. Além disso, o PC é considerado uma doença multifocal com vários focos tumorais exibindo diferentes características morfológicas, histológicas e moleculares⁴, que podem se originar independentemente ou derivar de um ancestral comum de células tumorais⁵. Estudos anteriores mostraram que a evolução do tumor difere entre os pacientes com base em fatores genéticos específicos que podem promover metástases ou confinar a linhagem celular à próstata⁵. Portanto, a caracterização molecular dos diferentes focos tumorais é crucial não apenas para fornecer um diagnóstico e prognóstico mais precisos, mas também para adaptar o tratamento eficaz e personalizado para o paciente.

Nesse contexto, a pesquisa biomédica e as abordagens multiômicas integrativas estão oferecendo oportunidades sem precedentes para classificar os cânceres em diferentes subtipos, identificar biomarcadores diagnósticos e prognósticos e descobrir marcadores relacionados à resposta ao tratamento. Além disso, essas abordagens contribuem para uma melhor compreensão da biologia dessa doença ^6,7. Amostras biológicas, sejam tecidos ou biofluidos, podem ser analisadas usando várias plataformas multiômicas (genômica, transcriptômica, proteômica, metabolômica, etc.) para descobrir as características biológicas subjacentes à fisiopatologia do câncer, abordando assim as limitações atuais relacionadas à heterogeneidade genética e fenotípica⁶. No entanto, é importante considerar que a qualidade dos dados derivados de estudos ômicos depende da qualidade das amostras coletadas dos tumores, de sua caracterização precisa e do posterior processamento e armazenamento⁸.

Nesse contexto, a obtenção de tecido PC fresco para pesquisa apresenta um desafio metodológico devido à dificuldade de amostragem tumoral bem-sucedida⁹. Os métodos anteriores envolviam amostragem aleatória após prostatectomia radical, com resultados ruins¹⁰. No entanto, abordagens mais recentes incorporam protocolos direcionados baseados em dados de ressonância magnética (RM) e biópsia, resultando em maior eficácia na coleta de amostras de tumor¹¹.

Por outro lado, a caracterização histopatológica das amostras antes de seu armazenamento sem alteração tecidual significativa também representa um desafio interessante. Consequentemente, em muitos casos, a determinação histopatológica das amostras é realizada após sua análise (por exemplo, análise metabolômica de RMN HR ¹H)¹². Essa prática acarreta gastos desnecessários, consumo de tempo e perda de um número significativo de amostras que acabam sendo excluídas da análise (por exemplo, amostras que, após análise histopatológica, acabam não sendo amostras de tumores). Em outros casos, a caracterização histopatológica das amostras é realizada antes de sua análise. De fato, alguns estudos anteriores tentaram padronizar métodos para fornecer amostras de pesquisa representativas de alta qualidade de espécimes de prostatectomia radical para genômica e metabolômica^13,14. No entanto, a eficiência da amostragem é significativamente maior quando realizada a partir de cortes já confirmados histologicamente (88%) que rompem o tecido, em comparação com quando realizada a partir de cortes não confirmados (45%)¹.

Aqui, uma nova metodologia é apresentada para superar essas limitações, visando obter amostras de PC frescas e bem caracterizadas antes do armazenamento no Biobanco. Este método foi desenvolvido através de esforços colaborativos entre diferentes serviços clínicos (Urologia, Patologia e Biobanco do Hospital La Fe). É importante destacar que os Biobancos desempenham um papel essencial na coleta, processamento, preservação e armazenamento de amostras biológicas, garantindo a alta qualidade das amostras e dados, bem como o cumprimento dos requisitos éticos e legais ^8,15,16.

Protocol

Este método foi desenvolvido através de esforços colaborativos envolvendo diferentes serviços clínicos (Urologia, Patologia e Biobanco do Hospital La Fe). O estudo foi conduzido em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e recebeu a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica do Instituto de Investigación Sanitaria Hospital Universitario y Politécnico La Fe (Valência, Espanha). Todas as amostras foram armazenadas no Biobanco Hospitalar La Fe (P…

Representative Results

Os resultados revelam que essa técnica possibilitou a obtenção de material tumoral em 61% dos casos estudados (25 de 41 casos) (Tabela 1). Tabela 1: Dados histopatológicos das amostras dos estudos. Resumo dos dados histopatológicos das amostras utilizadas no estudo. O cilindro de diagnóstico refere-se à amostra de biópsia de próstata obtida para fins de diagnóstico, enquanto o cilindro processado corresponde ao cilindro obtido da amostra de prostatec…

Discussion

Em qualquer pesquisa, a obtenção de amostras de qualidade é um requisito essencial para reduzir vieses sistemáticos e obter resultados confiáveis²². Portanto, o controle de variáveis pré-analíticas como a temperatura na qual as amostras são processadas e armazenadas, o tempo decorrido desde a coleta até o armazenamento da amostra, o uso de materiais esterilizados ou os efeitos que a adição de conservantes ou outros aditivos pode ter nas amostras deve ser considerado em qualquer protoco…

Materials

Cadiere forceps	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	Part number: 471049. 18 uses.
Conventional slides	Knittel Glass	2021	Ground/ Frosted end
Cryostat microtome	Thermo Fisher Scientific	—	Criostato CryoStar NX50
Cryotubes	Greiner Bio-One GmbH	Ref.: 122280.	CRYO S. PP, with screw cap, sterile.
Da Vinci surgical system	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	XI model
Dissection instruments	Bayer	—	Two tweezers and a surgical blade
DPX Eukitt	Medizin- und Labortechnik GmbH	6.00.01.0001.06.01.01
Eosin	Agilent	157252
Fenestrated bipolar forceps	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	Part number: 471205. 14 lives.
Force bipolar	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	Part number: 471405. 12 uses.
Freezers	Thermo Scientific		MODEL 907. -80 ºC
Hematoxylin	Agilent	157251
Inmunohistochemistry Slides	Agilent-Dako	K802021-2
Large needle driver	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	Part number: 471006. 15 uses.
Maryland bipolar forceps	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	Part number: 471172. 14 uses.
Microscope	Olympus	—	Olympus cx40
Microtome blades	PFM Medical	a35
Monopolar curved scissors	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	Part number: 470179. 10 uses.
OCT compound	NEG-50	LOT.117340
PlusSpeed S Single-use Biopsy Device with beveled tip	Peter Pflugbeil GmbH	PSS-1825-S
ProGasp forceps	Intuitive	PN1052082-US 10/2021	Part number: 471093. 18 uses.
Sample holder Disc	Davidson Cryo Chuck. BradleyProducts		30 mm
Tissue ink	Pelikan	2021	Ink 4001 brilliant black (301168)
Xylol	Quimipur	Ref. 169