通过改进采样技术和组织学表征提高前列腺肿瘤生物样本库的可靠性
1Department of Pathology,Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 2Department of Urology,Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 3Biobanco La Fe,Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, 4Department of Medicine,Jaume I University of Castellon, 5Department of Surgery,University of Valencia, 6Department of Pathology,University of Valencia
Summary
该协议描述了一种促进从根治性前列腺切除术标本收集样本的方法。目标是根据解剖病理学标准对标本中的组织样本进行映射、表征和微观-宏观解剖，然后再将它们储存在生物样本库中。
Abstract
获取新鲜且表征良好的肿瘤组织样本对于进行高质量的“组学”研究至关重要。然而，由于前列腺癌 （PC） 的独特性质以及与该肿瘤相关的高度异质性，它在前列腺癌 （PC） 的背景下可能特别具有挑战性。另一方面，在样本储存前对样本进行组织病理学表征而不引起显着的组织改变也是一个有趣的挑战。在这种情况下，我们提出了一种基于解剖病理学标准获取、映射、表征和显微解剖切除前列腺组织的新方法。
与以前发表的方案不同，该方法减少了前列腺标本组织病理学分析所需的时间，而不会影响其结构，这对于评估手术边缘至关重要。此外，它还能够对新鲜前列腺组织样本进行描绘和微观-宏观解剖，重点关注由病理标准定义的组织学肿瘤区域，如格里森评分、前体病变（高级别前列腺上皮内瘤变 – PIN）和炎症性病变（前列腺炎）。然后将这些样本储存在生物样本库中，用于后续研究分析。
Introduction
前列腺癌 （PC） 是男性第 2 大常见癌症，也是全球第5 大死因1。患者的治疗和预后取决于肿瘤的分期和分级（Gleason评分），与高Gleason分级和转移性肿瘤（31%）相比，局限性和低级别肿瘤（Gleason 6级）（99%）的5年生存率更高2。
PC 局部复发和治疗失败与该肿瘤3 型的特征性高遗传瘤内异质性有关。此外，PC 被认为是一种多灶性疾病，具有多个肿瘤病灶表现出不同的形态学、组织学和分子学特征4，这些病灶可能独立起源或源自共同的肿瘤细胞祖先5。先前的研究表明，基于特定的遗传驱动因素，患者的肿瘤进化存在差异，这些遗传驱动因素可以促进转移或将细胞谱系限制在前列腺5。因此，不同肿瘤病灶的分子表征不仅对于提供更准确的诊断和预后至关重要，而且对于为患者定制有效和个性化的治疗也至关重要。
在此背景下，生物医学研究和综合多组学方法为将癌症分类为不同的亚型、识别诊断和预后生物标志物以及发现与治疗反应相关的标志物提供了前所未有的机会。此外，这些方法有助于更好地理解这种疾病的生物学特性 6,7。生物样本，无论是组织还是生物流体，都可以使用各种多组学平台（基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等）进行分析，以揭示癌症病理生理学的生物学特征，从而解决当前与遗传和表型异质性相关的限制6.然而，重要的是要考虑到，从组学研究中获得的数据质量取决于从肿瘤收集的样本的质量、它们的准确表征以及随后的处理和储存8.
在这种情况下，由于成功取样肿瘤的困难，获得新鲜的 PC 组织进行研究提出了方法学挑战9.以前的方法涉及根治性前列腺切除术后的随机抽样，结果很差10。然而，最近的方法结合了基于磁共振成像 （MRI） 和活检数据的靶向方案，从而提高了肿瘤样本采集的疗效11。
另一方面，在不发生重大组织改变的情况下，在储存样品之前对样本进行组织病理学表征也提出了一个有趣的挑战。因此，在许多情况下，样本的组织病理学测定是在分析样本后进行的（例如，HR 1H NMR 代谢组学分析）12。这种做法会带来不必要的费用、时间消耗和大量样本的损失，这些样本最终会被排除在分析之外（例如，经过组织病理学分析后，样本被证明不是肿瘤样本）。在其他情况下，样品的组织病理学表征是在分析之前进行的。事实上，以前的一些研究已经试图标准化方法，以提供来自根治性前列腺切除术标本的代表性高质量研究样本用于基因组学和代谢组学13,14。然而，与从未经证实的切片（45%）进行采样相比，从已经组织学证实的破坏组织的切片（88%）进行采样效率要高得多1。
在这里，提出了一种克服这些限制的新方法，旨在获得新鲜且表征良好的PC样品，然后再储存在生物样本库中。这种方法是通过不同临床服务（泌尿科、病理科和拉菲医院生物银行）之间的合作努力开发的。需要强调的是，生物样本库在生物样本的收集、处理、保存和储存方面发挥着至关重要的作用，同时确保样本和数据的高质量，并遵守道德和法律要求 8,15,16。
Protocol
这种方法是通过涉及不同临床服务（泌尿科、病理学和拉菲医院生物银行）的合作努力开发的。该研究是按照机构、国家和国际人类福利指南进行的，并获得了 Instituto de Investigación Sanitaria Hospital Universitario y Politécnico La Fe（西班牙瓦伦西亚）生物医学研究伦理委员会的批准。所有样本均储存在拉菲医院生物样本库（PT13/0010/0026）。整个过程详见 图 1。 <p class="jove_content big…
Representative Results
结果显示，该技术使得在61%的研究病例（41例中的25例）中获得肿瘤物质成为可能（表1）。 表1：研究样本的组织病理学数据。 研究中使用的样本的组织病理学数据摘要。诊断圆柱体是指为诊断目的而获得的前列腺活检样本，而处理过的圆柱体对应于为研究目的从前列腺切除术标本中获得的圆柱体。ND：无数据;LL： 左小叶;RL： 右小叶;TTB：肿瘤总负荷?…
Discussion
在任何研究中，获得高质量的样本是减少系统性偏差和获得可靠结果的基本要求22.因此，在任何涉及生物样品的方案中，都必须考虑分析前变量的控制，例如处理和储存样品的温度、从样品收集到储存所经过的时间、灭菌材料的使用或添加防腐剂或其他添加剂可能对样品产生的影响。这不仅是关键，而且样本的正确识别和编码以及它们的病理特征也至关重要。否则，可能会存储?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.L. 承认“Margarita Salas”博士后合同（编号 21-076），MAM-T 承认“Maria Zambrano”研究合同（编号 MAZ/2021/03 UP2021-021）。这两份合同都是由欧盟-下一代欧盟资助的。
Materials
| Cadiere forceps | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471049. 18 uses. |
| Conventional slides | Knittel Glass | 2021 | Ground/ Frosted end |
| Cryostat microtome | Thermo Fisher Scientific | — | Criostato CryoStar NX50 |
| Cryotubes | Greiner Bio-One GmbH | Ref.: 122280. | CRYO S. PP, with screw cap, sterile. |
| Da Vinci surgical system | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | XI model |
| Dissection instruments | Bayer | — | Two tweezers and a surgical blade |
| DPX Eukitt | Medizin- und Labortechnik GmbH | 6.00.01.0001.06.01.01 | |
| Eosin | Agilent | 157252 | |
| Fenestrated bipolar forceps | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471205. 14 lives. |
| Force bipolar | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471405. 12 uses. |
| Freezers | Thermo Scientific | MODEL 907. -80 ºC | |
| Hematoxylin | Agilent | 157251 | |
| Inmunohistochemistry Slides | Agilent-Dako | K802021-2 | |
| Large needle driver | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471006. 15 uses. |
| Maryland bipolar forceps | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471172. 14 uses. |
| Microscope | Olympus | — | Olympus cx40 |
| Microtome blades | PFM Medical | a35 | |
| Monopolar curved scissors | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 470179. 10 uses. |
| OCT compound | NEG-50 | LOT.117340 | |
| PlusSpeed S Single-use Biopsy Device with beveled tip | Peter Pflugbeil GmbH | PSS-1825-S | |
| ProGasp forceps | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471093. 18 uses. |
| Sample holder Disc | Davidson Cryo Chuck. BradleyProducts | 30 mm | |
| Tissue ink | Pelikan | 2021 | Ink 4001 brilliant black (301168) |
| Xylol | Quimipur | Ref. 169 |
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Cite This Article
Giner Moreno, E., Quereda-Flores, F., Hernández Chinchilla, J. A., Amigo Moreno, R., Perez Ruiz, M. D., Carcelén López, A., Rocher Benlloch, J., Molió Sanchís, P., Casares Calzada, A., Marqués-Torrejón, M. Á., Martínez-Cadenas, C., Ruiz Cerdá, J. L., Loras Monfort, A., Ramos Soler, D. Enhancing Prostate Tumor Biobanking Reliability with Improved Sampling Technique and Histological Characterization. J. Vis. Exp. (201), e65635, doi:10.3791/65635 (2023).