Summary

İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

Published: June 02, 2023
doi:

Summary

İşlevsel bölgeye yönelik florometri, protein alanı hareketlerini gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir. Bu tekniğin doğal hücrelerde uygulanması için modifikasyonu, artık murin izole iskelet kası liflerindeki voltaj kapılı Ca2 + kanallarından tek voltaj sensörü hareketlerinin tespit edilmesine ve izlenmesine izin vermektedir.

Abstract

İşlevsel bölgeye yönelik florometri, voltaj kapılı iyon kanalları da dahil olmak üzere çok sayıda membran proteininin yapı-fonksiyon ilişkisini araştırmak için tercih edilen teknik olmuştur. Bu yaklaşım öncelikle heterolog ekspresyon sistemlerinde, membran akımlarını, kanalların aktivitesinin elektriksel tezahürünü ve floresan ölçümlerini eşzamanlı olarak ölçmek ve yerel alan yeniden düzenlemelerini raporlamak için kullanılmıştır. İşlevsel sahaya yönelik florometri, elektrofizyoloji, moleküler biyoloji, kimya ve floresanı, sırasıyla floresan ve elektrofizyoloji yoluyla gerçek zamanlı yapısal yeniden düzenlemelerin ve fonksiyonların incelenmesine izin veren tek bir geniş kapsamlı teknikte birleştirir. Tipik olarak, bu yaklaşım, bir tiol-reaktif floresan boya ile test edilebilen bir sistein içeren mühendislik voltaj kapılı bir membran kanalı gerektirir. Yakın zamana kadar, proteinlerin bölgeye yönelik floresan etiketlemesi için kullanılan tiol-reaktif kimya, yalnızca Xenopus oositlerinde ve hücre hatlarında gerçekleştirildi ve birincil uyarılamayan hücrelere yaklaşımın kapsamını kısıtladı. Bu raporda, yetişkin iskelet kası hücrelerinde fonksiyonel bölgeye yönelik florometrinin, kas lifi elektriksel depolarizasyonunun kas kasılmasının aktivasyonu ile bağlantılı olduğu süreç olan uyarılma-kasılma eşleşmesinin erken adımlarını incelemek için uygulanabilirliği açıklanmaktadır. Bu protokol, in vivo elektroporasyon kullanarak yetişkin farelerin fleksör digitorum brevis’inin kas liflerine sistein mühendisliği ile tasarlanmış voltaj kapılı Ca2+ kanallarını (CaV1.1) tasarlamak ve transfekte etmek için metodolojileri ve fonksiyonel bölgeye yönelik florometri ölçümleri için gerekli sonraki adımları açıklamaktadır. Bu yaklaşım diğer iyon kanallarını ve proteinleri incelemek için uyarlanabilir. Memeli kasının fonksiyonel bölgeye yönelik florometrisinin kullanımı, uyarılabilirliğin temel mekanizmalarını incelemek için özellikle önemlidir.

Introduction

Canlı bir hücrede bilinen bir elektriksel uyarana yanıt olarak iyon kanalı konformasyonel yeniden düzenlemelerini izleme yeteneği, moleküler fizyoloji1 için değerli bir bilgi kaynağıdır. Voltaj kapılı iyon kanalları, transmembran voltajındaki değişiklikleri algılayan membran proteinleridir ve işlevleri voltaj değişimlerinden de etkilenir2. Geçen yüzyılda voltaj kelepçesi tekniklerinin geliştirilmesi, fizyologların membran depolarizasyonuna yanıt olarak voltaj kapılı iyon kanalları tarafından taşınan iyonik akımları gerçek zamanlı olarak incelemelerine izin verdi3. Voltaj kelepçesi teknolojisinin kullanımı, nöronlar ve kas gibi uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerini anlamada çok önemli olmuştur. 1970’lerde, voltaj kelepçesi arıtılması, voltaj kapılı kalsiyum (Ca V) ve sodyum (NaV) kanallarındaki geçit akımlarının (veya şarj hareketinin) algılanmasına izin verdi 4,5. Geçit akımları, hücre zarı6 boyunca elektrik alanındaki değişikliklere yanıt olarak voltaj sensörlerinin hareketinden kaynaklanan doğrusal olmayan kapasitif akımlardır. Geçit akımları, iyon kanalı açılışından önce veya ona eşlik eden moleküler yeniden düzenlemelerin elektriksel bir tezahürü olarak kabul edilir7. Bu akım ölçümleri kanalın işlevi hakkında değerli bilgiler sağlarken, hem iyonik akımlar hem de geçit akımları, voltaj kapılıkanalların 7 moleküller arası ve moleküller arası konformasyonel yeniden düzenlemelerinin dolaylı okumalarıdır.

İşlevsel bölgeye yönelik florometri (FSDF; voltaj kelepçeli florometri, VCF olarak da adlandırılır) 1990’ların başında geliştirilmiştir8 ve ilk kez, yerel konformasyonel değişiklikleri ve bir kanal proteininin işlevini gerçek zamanlı olarak doğrudan görüntüleme yeteneği sağlamıştır. Kanal mutajenezisi, elektrofizyoloji ve heterolog ekspresyon sistemlerinin bir kombinasyonunu kullanarak, aktive edici uyaran 9,10’a yanıt olarak spesifik kanalların veya reseptörlerin hareketli kısımlarını floresan olarak etiketlemek ve izlemek mümkündür. Bu yaklaşım, 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 gerilim kapılıiyon kanallarındaki voltaj algılama mekanizmalarını incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Yetkili incelemeler için bkz: 10,20,21,22,23.

Elektrik sinyallerinin başlatılması ve yayılması için kritik öneme sahip olan Ca V ve NaV kanalları, merkezi bir gözenek ve dört özdeş olmayan voltaj algılama alanına sahip bir ana α1 alt biriminden oluşur2. Farklı birincil yapılarına ek olarak, Ca V ve NaV kanalları, yardımcı alt birimleri24 olan çok alt birim kompleksleri olarak ifade edilir. Gerilime bağlı potasyum kanalları (K V), Na V veya CaV25’in tek bir alanına benzeyen dört alt birimden oluşur. Ca V ve NaV kanallarının gözenek oluşturan ve gerilim algılayan α1 alt birimi, altı benzersiz transmembran segmentinin dört ayrı alanı için tek bir polipeptit kodlaması ile oluşturulur (S1-S6; Şekil 1A) 24,26. S1 ila S4 transmembran segmentlerinden oluşan bölge voltaj algılama alanını (VSD) ve S5 ve S6 transmembran segmentleri gözenek alanı26’yı oluşturur. Her VSD’de, S4 α-sarmalı, membran depolarizasyonuna yanıt olarak hareket eden pozitif yüklü arginin veya lizin içerir (Şekil 1A, B)7. Birkaç on yıllık araştırma ve çok çeşitli deneysel yaklaşımlardan elde edilen sonuçlar, S4 segmentlerinin membran depolarizasyonuna yanıt olarak geçit akımları üreterek dışa doğru hareket ettiği öncülünü desteklemektedir6.

FSDF, bir iyon kanalı veya başka bir protein üzerindeki belirli bir sistein kalıntısına (yani, S4 α-sarmal) konjuge edilmiş bir tiyol-reaktif boyanın floresan değişikliklerini ölçer, çünkü kanal membran depolarizasyonuna veya diğer uyaranlara yanıt olarak işlev görür10. Aslında, FSDF başlangıçta kanalın ana voltaj sensörü olarak önerilen KV kanallarındaki S4 segmentinin, geçit yükleri membran potansiyeli 8,10’daki değişikliklere yanıt olarak hareket ettiğinde hareket edip etmediğini araştırmak için geliştirilmiştir. Gerilim kapılı iyon kanalları durumunda, FSDF, kanal fonksiyonu ölçümleriyle eşzamanlı olarak dört VSD’nin bağımsız konformasyonel yeniden düzenlemelerini (herhangi bir zamanda bir VSD’yi izleme) çözebilir. Gerçekten de, bu yaklaşımı kullanarak, bireysel VSD’lerin kanal aktivasyonu ve inaktivasyonunun belirli yönleriyle farklı şekilde ilişkili olduğu gösterilmiştir 12,27,28,29,30. Her VSD’nin kanalların işlevine katkısını belirlemek yüksek önem taşır ve kanal çalışmasını daha fazla aydınlatmak ve potansiyel olarak ilaç geliştirme için yeni hedefler belirlemek için kullanılabilir.

FSDF’nin heterolog ekspresyon sistemlerinde kullanılması, kanal fonksiyonunu indirgemeci bir perspektiften anlamamızı geliştirmede son derece yardımcı olmuştur10,23. Birçok indirgemeci yaklaşım gibi, avantajlar sunar ancak aynı zamanda sınırlamaları da vardır. Örneğin, önemli bir sınırlama, heterolog sistemdeki kanal nano ortamının kısmi olarak yeniden yapılandırılmasıdır. Çoğu zaman, iyon kanalları çok sayıda aksesuar alt birimi ve işlevlerini değiştiren çok sayıda başka protein ile etkileşime girer31. Prensip olarak, farklı kanallar ve bunların aksesuar alt birimleri, çoklu protein kodlama yapıları veya polisistronik plazmidler kullanılarak heterolog sistemlerde ifade edilebilir, ancak doğal ortamları tam olarak yeniden oluşturulamaz30,32.

Grubumuz yakın zamanda, kas lifi elektriksel depolarizasyonunun kas kasılmasının aktivasyonu ile bağlantılı olduğu süreç olan uyarma-kasılma eşleşmesinin (ECC) 33,34 erken adımlarının incelenmesi için doğal ayrışmış iskelet kası liflerinde FSDF’nin bir varyantını yayınladı 35,36. İlk kez, bu yaklaşım, yetişkin bir farklılaştırılmış kas lifi37’nin doğal ortamında voltaj kapılı L tipi Ca2 + kanalından (CaV1.1, DHPR olarak da bilinir) bireysel S4 voltaj sensörlerinin hareket takibine izin verdi. Bu, hızlı stimülasyona bağlı kendi kendine yayılan depolarizasyona izin veren hücrenin elektriksel aktivitesi, in vivo elektroporasyon yoluyla cDNA plazmidini eksprese etme yeteneği, hücre içindeki kanalların doğal yüksek ekspresyonu ve bölmeli organizasyonu ve yüksek hızlı görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıt cihazlarıyla uyumluluğu dahil olmak üzere bu hücre tipinin çoklu özellikleri göz önünde bulundurularak gerçekleştirildi. Daha önce, algılama cihazı olarak yüksek hızlı bir çizgi taramalı konfokal mikroskop kullandık37. Şimdi, tekniğin bir varyasyonu, sinyal alımı için bir fotodiyot kullanılarak sunulmaktadır. Bu fotodiyot tabanlı algılama sistemi, bu tekniğin diğer laboratuvarlarda uygulanmasını kolaylaştırabilir.

Burada, CaV1.1’den bireysel voltaj sensörü hareketinin incelenmesi için doğal hücrelerde FSDF’yi kullanmak için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. CaV1.1 kanalı bu makale boyunca örnek olarak kullanılmış olsa da, bu teknik diğer iyon kanallarının, reseptörlerin veya yüzey proteinlerinin hücre dışı erişilebilir alanlarına uygulanabilir.

Protocol

Bu protokol Maryland Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Aşağıdaki protokol, (1) moleküler yapı tasarımı ve sistein reaksiyona giren boya seçimi, (2) in vivo elektroporasyon, (3) kas diseksiyonu ve lif izolasyonu, (4) edinim kurulum tanımı, (5) gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) pozitif lif elektriksel aktivitesi ve sistein boyamasının değerlendirilmesi ve (6) sinyal edinimi ve işlenmesinden oluşan çoklu alt bölümlere ayrılmışt?…

Representative Results

Tekrarlanan alan stimülasyonuna yanıt olarak aksiyon potansiyellerinin yayılması tetiklendiğinde, belirli bir depolarizasyon frekansına yanıt olarak spesifik voltaj sensörü hareketini izlemek mümkündür. Şekil 6A’da gösterildiği gibi, VSD-II etiketli helislerin hareketi, 10 Hz’de uygulanan iki ardışık depolarizasyonun her birine yanıt olarak izlenebilir (yani, 100 ms aralıklı). Sinyal ağartma, taban çizgisi izine çıkarılarak düzeltilebilir (Şek…

Discussion

Burada, CaV1.1 kanalından bireysel voltaj sensörü hareketlerinin incelenmesi için kas liflerinde FSDF’yi yürütmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Bu teknikte birleştirilen adımların sayısı ve yaklaşımların çeşitliliği karmaşık görünse de, bu tekniklerin çoğu genellikle biyofizikçi / hücre biyoloğu laboratuvarlarında rutin olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, görünen karmaşıklık, esas olarak, tüm çeşitli yaklaşımların tek bir entegre teknikte birleştir…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. J. Vergara’ya (Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles) EGFP-CaV1.1 (tavşan) vahşi tip plazmidini paylaştığı için teşekkür ederiz. Yale Fizyoloji Bölümü Elektronik Laboratuvarı’na ve özellikle Henrik Abildgaard’a iz ve tutma devreli fotodiyotun tasarımı ve yapımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir R01-AR075726 ve R01-NS103777

Materials

Hyaluronidase SIGMA ALDRICH H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube Millipore Sigma EP022363719-500EA
1 mL syringe Millipore Sigma Z683531-100EA tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe Becton Dikinson 324702
35 mm non coated plastic plate Falcon, Corning 353001
60 mm non coated plastic plate Falcon, Corning 351007
Alcoholic whip PDI B60307
Alexa-533 cube LP Chroma 49907 Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp Sutter Instrumets LB-LS 672
Artificial tears cream Akorn NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" VWR 14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) SIGMA ALDRICH 203895
collagenase type I SIGMA ALDRICH C0130-1g
Cotton tip VWR VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation) BTX harvard apparatus 45-0120 10mm 2 needle array tips
EGFP cube Chroma 39002AT Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device BTX harvard apparatus ECM 830
EPC10 HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience) 895000
FBS Biotechne,  R&D Systems RND-S11150H Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish MatTek Life Science P35G-1.5-14-C
Isoflurane Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation 502017-250ml
Isothermal heating pad Braintree scientific inc 39DP
Laminin Thermo Fisher INV-23017015 Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb VWR 82024-554
LED 530 nm Sutter Instrumets 5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter Pall FG4579 acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM Invitrogen INV-11380037
MTS-5-TAMRA Biotium 89410-784 MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software OriginLab Corporation OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode Custom Made NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17 Olympus BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis SIGMA 267228-1G To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator WPI Pulsemaster A300
Shutter drive controller Uniblitz 100-2B
Shuttter Uniblitz VS2582T0-100
S-MEM Invitrogen INV-11380037
Sterile bench pad VWR DSI-B1623
Sterile saline SIGMA ALDRICH S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit Dow Corning 1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia Parkland Scientific V3000PK
Voltage generator Custom Made NA

References

  1. Catterall, W. A., Wisedchaisri, G., Zheng, N. The chemical basis for electrical signaling. Nature Chemical Biology. 13 (5), 455-463 (2017).
  2. Armstrong, C. M., Hille, B. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron. 20 (3), 371-380 (1998).
  3. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  4. Armstrong, C. M., Bezanilla, F. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature. 242 (5398), 459-461 (1973).
  5. Schneider, M. F., Chandler, W. K. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-contraction coupling. Nature. 242 (5395), 244-246 (1973).
  6. Bezanilla, F. Gating currents. The Journal of General Physiology. 150 (7), 911-932 (2018).
  7. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiological Reviews. 80 (2), 555-592 (2000).
  8. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  9. Akabas, M. H. Cysteine modification: probing channel structure, function and conformational change. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 25-54 (2015).
  10. Priest, M., Bezanilla, F. Functional site-directed fluorometry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 55-76 (2015).
  11. Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
  12. Pantazis, A., Savalli, N., Sigg, D., Neely, A., Olcese, R. Functional heterogeneity of the four voltage sensors of a human L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 18381-18386 (2014).
  13. Savalli, N., Kondratiev, A., Toro, L., Olcese, R. Voltage-dependent conformational changes in human Ca(2+)- and voltage-activated K(+) channel, revealed by voltage-clamp fluorometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (33), 12619-12624 (2006).
  14. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  15. Bannister, J. P. A., Chanda, B., Bezanilla, F., Papazian, D. M. Optical detection of rate-determining ion-modulated conformational changes of the ether-à-go-go K+ channel voltage sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (51), 18718-18723 (2005).
  16. Bruening-Wright, A., Elinder, F., Larsson, H. P. Kinetic relationship between the voltage sensor and the activation gate in spHCN channels. The Journal of General Physiology. 130 (1), 71-81 (2007).
  17. Osteen, J. D., et al. KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22710-22715 (2010).
  18. Smith, P. L., Yellen, G. Fast and slow voltage sensor movements in HERG potassium channels. The Journal of General Physiology. 119 (3), 275-293 (2002).
  19. Gonzalez, C., Koch, H. P., Drum, B. M., Larsson, H. P. Strong cooperativity between subunits in voltage-gated proton channels. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 51-56 (2010).
  20. Gandhi, C. S., Olcese, R. The voltage-clamp fluorometry technique. Methods in Molecular Biology. 491, 213-231 (2008).
  21. Horne, A. J., Fedida, D. Use of voltage clamp fluorimetry in understanding potassium channel gating: a review of Shaker fluorescence data. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 87 (6), 411-418 (2009).
  22. Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
  23. Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. The Journal of General Physiology. 151 (10), 1163-1172 (2019).
  24. Catterall, W. A., Lenaeus, M. J., Gamal El-Din, T. M. Structure and pharmacology of voltage-gated sodium and calcium channels. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 60, 133-154 (2020).
  25. MacKinnon, R. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature. 350 (6315), 232-235 (1991).
  26. Wu, J., et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 Å resolution. Nature. 537 (7619), 191-196 (2016).
  27. Capes, D. L., Goldschen-Ohm, M. P., Arcisio-Miranda, M., Bezanilla, F., Chanda, B. Domain IV voltage-sensor movement is both sufficient and rate limiting for fast inactivation in sodium channels. The Journal of General Physiology. 142 (2), 101-112 (2013).
  28. Cha, A., Ruben, P. C., George, A. L., Fujimoto, E., Bezanilla, F. Voltage sensors in domains III and IV, but not I and II, are immobilized by Na+ channel fast inactivation. Neuron. 22 (1), 73-87 (1999).
  29. Muroi, Y., Arcisio-Miranda, M., Chowdhury, S., Chanda, B. Molecular determinants of coupling between the domain III voltage sensor and pore of a sodium channel. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (2), 230-237 (2010).
  30. Savalli, N., et al. The distinct role of the four voltage sensors of the skeletal CaV1.1 channel in voltage-dependent activation. The Journal of General Physiology. 153 (11), e202112915 (2021).
  31. Muller, C. S., et al. Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (34), 14950-14957 (2010).
  32. Perni, S., Lavorato, M., Beam, K. G. De novo reconstitution reveals the proteins required for skeletal muscle voltage-induced Ca2+ release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (52), 13822-13827 (2017).
  33. Beam, K. G., Horowicz, P. . Excitation-Contraction Coupling in Skeletal Muscle. , (2004).
  34. Schneider, M. F., Hernandez-Ochoa, E. O. . Muscle: Fundamental Biology and Mechanisms of Disease. , 811-822 (2012).
  35. Rios, E., Pizarro, G. Voltage sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiological Reviews. 71 (3), 849-908 (1991).
  36. Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage sensing mechanism in skeletal muscle excitation-contraction coupling: coming of age or midlife crisis. Skeletal Muscle. 8 (1), 22 (2018).
  37. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of CaV1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (40), e2026116118 (2021).
  38. DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1520 (2009).
  39. Blunck, R., Starace, D. M., Correa, A. M., Bezanilla, F. Detecting rearrangements of shaker and NaChBac in real-time with fluorescence spectroscopy in patch-clamped mammalian cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3966-3980 (2004).
  40. Liu, Y., Carroll, S. L., Klein, M. G., Schneider, M. F. Calcium transients and calcium homeostasis in adult mouse fast-twitch skeletal muscle fibers in culture. The American Journal of Physiology. 272 (6), C1919-C1927 (1997).
  41. Hernandez-Ochoa, E. O., Vanegas, C., Iyer, S. R., Lovering, R. M., Schneider, M. F. Alternating bipolar field stimulation identifies muscle fibers with defective excitability but maintained local Ca(2+) signals and contraction. Skeletal Muscle. 6, 6 (2016).
  42. Klein, M. G., Simon, B. J., Szucs, G., Schneider, M. F. Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high- and low-affinity calcium indicators. Biophysical Journal. 53 (6), 971-988 (1988).
  43. Irving, M., Maylie, J., Sizto, N. L., Chandler, W. K. Intrinsic optical and passive electrical properties of cut frog twitch fibers. The Journal of General Physiology. 89 (1), 1-40 (1987).
  44. Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca(2+) release in adult skeletal muscle fibres. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 108 (3), 98-118 (2012).
  45. Banks, Q., et al. Optical recording of action potential initiation and propagation in mouse skeletal muscle fibers. Biophysical Journal. 115 (11), 2127-2140 (2018).
  46. Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap II: more recent advances in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The Journal of Experimental Biology. 219, 175-182 (2016).
  47. Bannister, R. A., Beam, K. G. Ca(V)1.1: The atypical prototypical voltage-gated Ca2+ channel. Biochimica et Biophysica Acta. 1828 (7), 1587-1597 (2013).
  48. Beard, N. A., Wei, L., Dulhunty, A. F. Ca(2+) signaling in striated muscle: the elusive roles of triadin, junctin, and calsequestrin. European Biophysics Journal. 39 (1), 27-36 (2009).
  49. Polster, A., Perni, S., Bichraoui, H., Beam, K. G. Stac adaptor proteins regulate trafficking and function of muscle and neuronal L-type Ca2+ channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 602-606 (2015).
  50. Perni, S. The builders of the junction: roles of Junctophilin1 and Junctophilin2 in the assembly of the sarcoplasmic reticulum-plasma membrane junctions in striated muscle. Biomolecules. 12 (1), 109 (2022).

Play Video

Cite This Article
Bibollet, H., Bennett, D. F., Schneider, M. F., Hernández-Ochoa, E. O. Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability. J. Vis. Exp. (196), e65311, doi:10.3791/65311 (2023).

View Video