القياس الفلوري الوظيفي الموجه للموقع هو طريقة لدراسة حركات مجال البروتين في الوقت الفعلي. يسمح تعديل هذه التقنية لتطبيقها في الخلايا الأصلية الآن باكتشاف وتتبع حركات مستشعر الجهد الفردي من قنوات Ca2+ ذات الجهد الكهربائي في ألياف العضلات الهيكلية المعزولة بالفئران.
كان القياس الفلوري الوظيفي الموجه للموقع هو التقنية المفضلة للتحقيق في العلاقة بين البنية والوظيفة للعديد من البروتينات الغشائية ، بما في ذلك القنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي. تم استخدام هذا النهج في المقام الأول في أنظمة التعبير غير المتجانسة لقياس التيارات الغشائية في وقت واحد ، والمظاهر الكهربائية لنشاط القنوات ، وقياسات التألق ، والإبلاغ عن إعادة ترتيب المجال المحلي. يجمع القياس الفلوري الوظيفي الموجه للموقع بين الفيزيولوجيا الكهربية والبيولوجيا الجزيئية والكيمياء والتألق في تقنية واحدة واسعة النطاق تسمح بدراسة عمليات إعادة الترتيب الهيكلية في الوقت الفعلي والوظيفة من خلال التألق والفيزيولوجيا الكهربية ، على التوالي. عادة ، يتطلب هذا النهج قناة غشاء مهندسة ذات بوابات الجهد تحتوي على سيستين يمكن اختباره بواسطة صبغة فلورية تفاعلية مع الثيول. حتى وقت قريب ، تم تنفيذ الكيمياء التفاعلية للثيول المستخدمة في وضع العلامات الفلورية الموجهة للموقع للبروتينات حصريا في بويضات Xenopus وخطوط الخلايا ، مما يحد من نطاق النهج إلى الخلايا الأولية غير القابلة للاستثارة. يصف هذا التقرير إمكانية تطبيق القياس الفلوري الوظيفي الموجه للموقع في خلايا العضلات الهيكلية البالغة لدراسة الخطوات المبكرة لاقتران الإثارة والانكماش ، وهي العملية التي يرتبط بها إزالة الاستقطاب الكهربائي للألياف العضلية بتنشيط تقلص العضلات. يصف هذا البروتوكول منهجيات تصميم ونقل قنوات Ca2 + المهندسة بالجهد (CaV1.1) إلى ألياف العضلات في المثنية الرقمية للفئران البالغة باستخدام التثقيب الكهربائي في الجسم الحي والخطوات اللاحقة المطلوبة لقياسات الفلور الوظيفية الموجهة للموقع. يمكن تكييف هذا النهج لدراسة القنوات الأيونية والبروتينات الأخرى. إن استخدام القياس الفلوري الوظيفي الموجه للموقع لعضلات الثدييات له أهمية خاصة لدراسة الآليات الأساسية للإثارة.
تعد القدرة على تتبع عمليات إعادة ترتيب مطابقة القناة الأيونية استجابة لمحفز كهربائي معروف في خلية حية مصدرا للمعلومات القيمة لعلم وظائف الأعضاء الجزيئي1. القنوات الأيونية ذات بوابات الجهد هي بروتينات غشائية تستشعر التغيرات في الجهد عبر الغشاء ، وتتأثر وظيفتها أيضا بتغيرات الجهد2. سمح تطوير تقنيات مشبك الجهد في القرن الماضي لعلماء الفسيولوجيا بدراسة التيارات الأيونية التي تحملها القنوات الأيونية ذات بوابات الجهد في الوقت الفعلي استجابة لإزالة استقطاب الغشاء3. كان استخدام تقنية مشبك الجهد أمرا حاسما في فهم الخصائص الكهربائية للخلايا القابلة للإثارة مثل الخلايا العصبية والعضلات. في سبعينيات القرن العشرين ، سمح صقل مشبك الجهد للكشف عن تيارات البوابات (أو حركة الشحن) في قنوات الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي (Ca V) والصوديوم (NaV) 4,5. تيارات البوابة هي تيارات سعوية غير خطية تنشأ من حركة مستشعرات الجهد استجابة للتغيرات في المجال الكهربائي عبر غشاء الخلية6. تعتبر تيارات البوابة مظهرا كهربائيا لإعادة الترتيب الجزيئي الذي يسبق أو يصاحب فتح القناة الأيونية7. في حين أن هذه القياسات الحالية توفر معلومات قيمة فيما يتعلق بوظيفة القناة ، فإن كل من التيارات الأيونية وتيارات البوابة هي قراءات غير مباشرة لإعادة ترتيب المطابقة بين الجزيئات وداخلها للقنوات ذات الجهدالكهربائي 7.
تم تطوير القياس الفلوري الوظيفي الموجه للموقع (FSDF ؛ يشار إليه أيضا باسم قياس فلورومترية مشبك الجهد ، VCF) في أوائل تسعينيات القرن العشرين8 ، ولأول مرة ، قدم القدرة على عرض التغييرات التوافقية المحلية مباشرة ووظيفة بروتين القناة في الوقت الحقيقي. باستخدام مزيج من طفرات القناة ، والفيزيولوجيا الكهربية ، وأنظمة التعبير غير المتجانسة ، من الممكن وضع علامة على الأجزاء المتحركة لقنوات أو مستقبلات معينة وتتبعها استجابة لمحفز التنشيط 9,10. تم استخدام هذا النهج على نطاق واسع لدراسة آليات استشعار الجهد في القنوات الأيونية ذات بوابات الجهد8،10،11،12،13،14،15،16،17،18،19. للاطلاع على مراجعات موثوقة، راجع10،20،21،22،23.
تتكون قنوات Ca V و NaV ، الحاسمة لبدء الإشارات الكهربائية وانتشارها ، من وحدة فرعية رئيسية α1 ، والتي تمتلك مسام مركزية وأربعة مجالات استشعار جهد غير متطابقة2. بالإضافة إلى هيكلها الأساسي المميز ، يتم التعبير عن قنوات Ca V و NaV كمعقدات متعددة الوحدات الفرعية مع وحدات فرعية مساعدة24. تتكون قنوات البوتاسيوم المعتمدة على الجهد (K V) من أربع وحدات فرعية تشبه مجالا واحدا من Na V أو CaV 25. يتم تشكيل الوحدة الفرعية α1 المكونة للمسام واستشعار الجهد لقنوات Ca V و NaV بواسطة تشفير ببتيد واحد لأربعة مجالات فردية من ستة قطاعات غشائية فريدة (S1-S6; الشكل 1 أ) 24,26. تشكل المنطقة المكونة من شرائح الغشاء S1 إلى S4 مجال استشعار الجهد (VSD) وتشكل الأجزاء عبر الغشاء S5 و S6 مجال المسام26. في كل VSD ، يحتوي S4 α-helix على أرجينين أو ليسين موجب الشحنة (الشكل 1A ، B) يتحرك استجابة لإزالة استقطاب الغشاء7. تدعم عدة عقود من البحث ونتائج الأساليب التجريبية المتنوعة للغاية الفرضية القائلة بأن شرائح S4 تتحرك إلى الخارج ، وتولد تيارات بوابات ، استجابة لإزالة استقطاب الغشاء6.
يقيس FSDF التغيرات الفلورية لصبغة تفاعلية ثيول مترافقة مع بقايا سيستين محددة (أي S4 α-helix) على قناة أيونية أو بروتين آخر ، تم هندسته عبر الطفرات الموجهة للموقع ، حيث تعمل القناة استجابة لإزالة استقطاب الغشاء أو المحفزاتالأخرى 10. في الواقع ، تم تطوير FSDF في الأصل للتحقيق فيما إذا كان الجزء S4 في قنوات KV ، المقترح أن يكون مستشعر الجهد الرئيسي للقناة ، يتحرك عندما تتحرك شحنات البوابة استجابة للتغيرات في إمكانات الغشاء 8,10. في حالة القنوات الأيونية ذات بوابات الجهد ، يمكن ل FSDF حل عمليات إعادة الترتيب التوافقي المستقلة ل VSDs الأربعة (تتبع VSD واحد في أي وقت) ، بالتزامن مع قياسات وظيفة القناة. في الواقع ، باستخدام هذا النهج ، تبين أن VSDs الفردية يبدو أنها تشارك بشكل مختلف في جوانب محددة من تنشيط القناة وتعطيلها12،27،28،29،30. إن تحديد مساهمة كل VSD في وظيفة القنوات له أهمية كبيرة ويمكن استخدامه لزيادة توضيح تشغيل القناة وربما تحديد أهداف جديدة لتطوير الأدوية.
كان استخدام FSDF في أنظمة التعبير غير المتجانسة مفيدا للغاية في تعزيز فهمنا لوظيفة القناة من منظور اختزالي10،23. ومثل العديد من النهج الاختزالية، فإنه يقدم مزايا ولكن له أيضا قيود. على سبيل المثال ، أحد القيود الرئيسية هو إعادة التكوين الجزئي لبيئة نانو القناة في النظام غير المتجانس. في كثير من الأحيان ، تتفاعل القنوات الأيونية مع العديد من الوحدات الفرعية الملحقة والعديد من البروتينات الأخرى التي تعدل وظيفتها31. من حيث المبدأ ، يمكن التعبير عن القنوات المختلفة ووحداتها الفرعية الملحقة في أنظمة غير متجانسة باستخدام تركيبات ترميز البروتين المتعددة أو البلازميدات متعددة السيسترونيك ، ولكن لا يمكن إعادة تشكيل بيئتها الأصلية بالكامل30,32.
نشرت مجموعتنا مؤخرا نوعا مختلفا من FSDF في ألياف العضلات الهيكلية المنفصلة الأصلية لدراسة الخطوات المبكرة لاقتران الإثارة والانكماش (ECC) 33,34 ، وهي العملية التي يرتبط بها إزالة الاستقطاب الكهربائي للألياف العضلية بتنشيط تقلص العضلات 35,36. لأول مرة ، سمح هذا النهج بتتبع حركة مستشعرات الجهد S4 الفردية من قناة L-type Ca2+ ذات الجهد الكهربائي (CaV1.1 ، والمعروفة أيضا باسم DHPR) في البيئة الأصلية لألياف العضلات المتمايزةللبالغين 37. تم تحقيق ذلك من خلال النظر في الخصائص المتعددة لهذا النوع من الخلايا ، بما في ذلك النشاط الكهربائي للخلية مما يسمح بإزالة الاستقطاب ذاتية الانتشار التي يسببها التحفيز السريع ، والقدرة على التعبير عن بلازميد cDNA من خلال التثقيب الكهربائي في الجسم الحي ، والتعبير الطبيعي العالي والتنظيم المجزأ للقنوات داخل الخلية ، وتوافقه مع التصوير عالي السرعة وأجهزة التسجيل الكهربية. في السابق ، استخدمنا مجهرا متحد البؤر لمسح الخط عالي السرعة كجهاز كشف37. الآن ، يتم تقديم تباين في التقنية باستخدام الصمام الثنائي الضوئي لاكتساب الإشارة. يمكن لنظام الكشف القائم على الصمام الثنائي الضوئي هذا أن يسهل تنفيذ هذه التقنية في مختبرات أخرى.
هنا ، يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة لاستخدام FSDF في الخلايا الأصلية لدراسة حركة مستشعر الجهد الفردي من CaV1.1. بينما تم استخدام قناة CaV1.1 كمثال في جميع أنحاء هذه المخطوطة ، يمكن تطبيق هذه التقنية على المجالات التي يمكن الوصول إليها خارج الخلية للقنوات الأيونية الأخرى أو المستقبلات أو البروتينات السطحية.
هنا ، يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء FSDF في ألياف العضلات لدراسة حركات مستشعر الجهد الفردي من قناة CaV1.1. على الرغم من أن عدد الخطوات وتنوع الأساليب التي يتم دمجها في هذه التقنية قد يبدو معقدا ، إلا أن معظم هذه التقنيات غالبا ما تستخدم بشكل روتيني في مختبرات الفيزياء الحيوية / علماء ?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور ج. فيرغارا (جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس) على مشاركة البلازميد من النوع البري EGFP-CaV1.1 (أرنب). نشكر قسم ييل لمختبر إلكترونيات علم وظائف الأعضاء وخاصة هنريك أبيلدجارد لتصميم وبناء الصمام الثنائي الضوئي مع دائرة المسار والتعليق. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01-AR075726 و R01-NS103777
Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated |
glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
Photodiode | Custom Made | NA | |
PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacyte field stimulation electrode |
Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
Voltage generator | Custom Made | NA |