La fluorométrie fonctionnelle dirigée par site est une méthode permettant d’étudier les mouvements du domaine protéique en temps réel. La modification de cette technique pour son application dans les cellules natives permet maintenant la détection et le suivi des mouvements du capteur de tension unique à partir de canaux Ca2+ voltage-dépendants dans des fibres musculaires squelettiques isolées murines.
La fluorométrie fonctionnelle dirigée vers le site a été la technique de choix pour étudier la relation structure-fonction de nombreuses protéines membranaires, y compris les canaux ioniques voltage-dépendants. Cette approche a été utilisée principalement dans les systèmes d’expression hétérologues pour mesurer simultanément les courants membranaires, la manifestation électrique de l’activité des canaux et les mesures de fluorescence, rapportant des réarrangements de domaine local. La fluorométrie fonctionnelle dirigée par site combine l’électrophysiologie, la biologie moléculaire, la chimie et la fluorescence en une seule technique de grande envergure qui permet d’étudier les réarrangements structurels en temps réel et la fonction par fluorescence et électrophysiologie, respectivement. En règle générale, cette approche nécessite un canal membranaire voltage-dépendant qui contient une cystéine qui peut être testée par un colorant fluorescent thiol-réactif. Jusqu’à récemment, la chimie réactive aux thiols utilisée pour le marquage fluorescent dirigé des protéines était réalisée exclusivement dans les ovocytes et les lignées cellulaires Xenopus , limitant la portée de l’approche aux cellules primaires non excitables. Ce rapport décrit l’applicabilité de la fluorométrie fonctionnelle dirigée sur le site dans les cellules musculaires squelettiques adultes pour étudier les premières étapes du couplage excitation-contraction, le processus par lequel la dépolarisation électrique des fibres musculaires est liée à l’activation de la contraction musculaire. Le présent protocole décrit les méthodologies de conception et de transfection des canaux Ca2+ voltage-dépendants modifiés par cystéine (CaV1.1) dans les fibres musculaires du fléchisseur digitorum brevis de souris adultes en utilisant l’électroporation in vivo et les étapes ultérieures requises pour les mesures fluorométriques fonctionnelles dirigées vers le site. Cette approche peut être adaptée pour étudier d’autres canaux ioniques et protéines. L’utilisation de la fluorométrie fonctionnelle dirigée sur le site du muscle des mammifères est particulièrement pertinente pour étudier les mécanismes de base de l’excitabilité.
La capacité de suivre les réarrangements conformationnels des canaux ioniques en réponse à un stimulus électrique connu dans une cellule vivante est une source d’informations précieuses pour la physiologie moléculaire1. Les canaux ioniques voltage-dépendants sont des protéines membranaires qui détectent les changements de tension transmembranaire, et leur fonction est également affectée par les changements de tension2. Le développement des techniques de pince de tension au siècle dernier a permis aux physiologistes d’étudier, en temps réel, les courants ioniques transportés par les canaux ioniques voltage-dépendants en réponse à la dépolarisation membranaire3. L’utilisation de la technologie de pince de tension a été cruciale pour comprendre les propriétés électriques des cellules excitables telles que les neurones et les muscles. Dans les années 1970, le raffinement de la pince de tension a permis la détection des courants de déclenchement (ou mouvement de charge) dans les canaux 4,5 dépendants de la tensiondu calcium (Ca V) et du sodium (NaV). Les courants de déclenchement sont des courants capacitifs non linéaires qui résultent du mouvement des capteurs de tension en réponse aux changements du champ électrique à travers la membrane cellulaire6. Les courants de déclenchement sont considérés comme une manifestation électrique des réarrangements moléculaires qui précèdent ou accompagnent l’ouverture du canal ionique7. Bien que ces mesures de courant fournissent des informations précieuses sur la fonction du canal, les courants ioniques et les courants de déclenchement sont des lectures indirectes des réarrangements conformationnels inter- et intramoléculaires des canaux voltage-dépendants7.
La fluorométrie fonctionnelle dirigée sur site (FSDF; également appelée fluorométrie à pince de tension, VCF) a été développée au début des années 19908 et, pour la première fois, a permis de visualiser directement les changements conformationnels locaux et la fonction d’une protéine de canal en temps réel. En utilisant une combinaison de mutagénèse des canaux, d’électrophysiologie et de systèmes d’expression hétérologues, il est possible de marquer et de suivre par fluorescence les parties mobiles de canaux ou de récepteurs spécifiques en réponse au stimulus activateur 9,10. Cette approche a été largement utilisée pour étudier les mécanismes de détection de tension dans les canaux ioniques voltage-dépendants 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Pour les examens faisant autorité, voir 10,20,21,22,23.
Les canaux Ca V et NaV, critiques pour l’initiation et la propagation des signaux électriques, sont composés d’une sous-unité principale α1, qui possède un pore central et quatre domaines de détection de tensionnon identiques2. En plus de leur structure primaire distincte, les canaux Ca V et NaV sont exprimés en complexes multi-sous-unités avec des sous-unités auxiliaires24. Les canaux potassiques voltage-dépendants (K V) sont constitués de quatre sous-unités qui ressemblent à un seul domaine de Na V ou CaV25. La sous-unité α1 formant des pores et détectant la tension des canaux Ca V et NaV est formée par un seul polypeptide codant pour quatre domaines individuels de six segments transmembranaires uniques (S1-S6; Figure 1A) 24,26. La région comprise par les segments transmembranaires S1 à S4 forme le domaine de détection de tension (VSD) et les segments transmembranaires S5 et S6 forment le domaine poreux26. Dans chaque VSD, la α-hélice S4 contient de l’arginine ou de la lysine chargée positivement (Figure 1A,B) qui se déplacent en réponse à la dépolarisation de la membrane7. Plusieurs décennies de recherche et les résultats d’approches expérimentales très diverses soutiennent la prémisse selon laquelle les segments S4 se déplacent vers l’extérieur, générant des courants de gating, en réponse à la dépolarisation de la membrane6.
FSDF mesure les changements de fluorescence d’un colorant thiol-réactif conjugué à un résidu spécifique de cystéine (c.-à-d. l’hélice α-hélice S4) sur un canal ionique ou une autre protéine, conçu par mutagénèse dirigée, lorsque le canal fonctionne en réponse à la dépolarisation de la membrane ou à d’autres stimuli10. En fait, FSDF a été développé à l’origine pour étudier si le segment S4 dans les canaux KV, proposé pour être le capteur de tension principal du canal, se déplace lorsque les charges de déclenchement se déplacent en réponse aux changements de potentiel de membrane 8,10. Dans le cas de canaux ioniques voltage-dépendants, FSDF peut résoudre des réarrangements conformationnels indépendants des quatre VSD (suivi d’un VSD à un moment donné), en même temps que les mesures de la fonction du canal. En effet, en utilisant cette approche, il a été démontré que les VSD individuels semblent être impliqués différemment dans des aspects spécifiques de l’activation et de l’inactivation des canaux 12,27,28,29,30. L’identification de la contribution de chaque VSD à la fonction des canaux est d’une grande pertinence et peut être utilisée pour élucider davantage le fonctionnement des canaux et potentiellement identifier de nouvelles cibles pour le développement de médicaments.
L’utilisation de la FSDF dans les systèmes d’expression hétérologues a été extrêmement utile pour approfondir notre compréhension de la fonction des canaux dans une perspective réductionniste10,23. Comme beaucoup d’approches réductionnistes, elle présente des avantages mais a aussi des limites. Par exemple, une limitation majeure est la reconstitution partielle du nanoenvironnement du canal dans le système hétérologue. Souvent, les canaux ioniques interagissent avec de nombreuses sous-unités accessoires et de nombreuses autres protéines qui modifient leur fonction31. En principe, différents canaux et leurs sous-unités accessoires peuvent être exprimés dans des systèmes hétérologues avec l’utilisation de constructions codantes protéiques multiples ou de plasmides polycistroniques, mais leur environnement natif ne peut pas être entièrement reconstitué30,32.
Notre groupe a récemment publié une variante de FSDF dans des fibres musculaires squelettiques dissociées natives pour l’étude des étapes précoces du couplage excitation-contraction (ECC)33,34, le processus par lequel la dépolarisation électrique des fibres musculaires est liée à l’activation de la contraction musculaire35,36. Pour la première fois, cette approche a permis le suivi de mouvement de capteurs de tension S4 individuels à partir du canal Ca2+ de type L voltage-dépendant (CaV1.1, également connu sous le nom de DHPR) dans l’environnement natif d’une fibre musculaire différenciéeadulte 37. Cela a été accompli en considérant de multiples caractéristiques de ce type de cellule, y compris l’activité électrique de la cellule permettant une dépolarisation auto-propagée induite par stimulation rapide, la capacité d’exprimer le plasmide de l’ADNc par électroporation in vivo, la haute expression naturelle et l’organisation compartimentale des canaux dans la cellule, et sa compatibilité avec les dispositifs d’imagerie et d’enregistrement électrophysiologique à grande vitesse. Auparavant, nous utilisions un microscope confocal à balayage linéaire à grande vitesse comme dispositifde détection 37. Maintenant, une variante de la technique est présentée à l’aide d’une photodiode pour l’acquisition du signal. Ce système de détection à base de photodiodes pourrait faciliter la mise en œuvre de cette technique dans d’autres laboratoires.
Ici, un protocole étape par étape pour utiliser FSDF dans les cellules natives pour l’étude du mouvement individuel du capteur de tension à partir de CaV1.1 est décrit. Bien que le canal CaV1.1 ait été utilisé comme exemple tout au long de ce manuscrit, cette technique pourrait être appliquée à des domaines extracellulaires accessibles d’autres canaux ioniques, récepteurs ou protéines de surface.
Ici, un protocole étape par étape pour effectuer FSDF dans les fibres musculaires pour l’étude des mouvements individuels du capteur de tension du canal CaV1.1 est décrit. Même si le nombre d’étapes et la diversité des approches combinées dans cette technique peuvent sembler complexes, la plupart de ces techniques sont souvent couramment utilisées dans les laboratoires de biophysiciens et de biologistes cellulaires. Ainsi, la complexité apparente réside principalement dans la combinaison de tout…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Dr J. Vergara (Université de Californie, Los Angeles) d’avoir partagé le plasmide de type sauvage EGFP-CaV1.1 (lapin). Nous remercions le Yale Department of Physiology Electronics Laboratory et surtout Henrik Abildgaard pour la conception et la construction de la photodiode avec circuit de piste et de maintien. Ce travail a été soutenu par les subventions R01-AR075726 et R01-NS103777 des National Institutes of Health
Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated |
glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
Photodiode | Custom Made | NA | |
PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacyte field stimulation electrode |
Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
Voltage generator | Custom Made | NA |