פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר היא שיטה לחקר תנועות תחום החלבונים בזמן אמת. שינוי טכניקה זו ליישומה בתאים מקומיים מאפשר כעת זיהוי ומעקב אחר תנועות חיישן מתח יחיד מתעלות Ca2+ מגודרות מתח בסיבי שריר שלד מבודדים.
פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר הייתה הטכניקה הנבחרת לחקור את יחסי מבנה-פונקציה של חלבוני ממברנה רבים, כולל תעלות יונים מגודרות מתח. גישה זו שימשה בעיקר במערכות ביטוי הטרולוגיות כדי למדוד בו זמנית זרמי ממברנה, את הביטוי החשמלי של פעילות התעלות, ומדידות פלואורסצנטיות, המדווחות על סידורים מחדש של תחומים מקומיים. פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר משלבת אלקטרופיזיולוגיה, ביולוגיה מולקולרית, כימיה ופלואורסצנטיות לטכניקה רחבה אחת המאפשרת לחקור סידורים מבניים בזמן אמת ותפקוד באמצעות פלואורסצנטיות ואלקטרופיזיולוגיה, בהתאמה. בדרך כלל, גישה זו דורשת תעלת ממברנה מגודרת מתח מהונדסת המכילה ציסטאין שניתן לבדוק על ידי צבע פלואורסצנטי תגובתי תיול. עד לאחרונה, הכימיה הריאקטיבית של תיול המשמשת לתיוג פלואורסצנטי מכוון אתר של חלבונים בוצעה אך ורק בביציות ובקווי תאים של קסנופוס , מה שהגביל את היקף הגישה לתאים ראשוניים שאינם מעוררים. דו”ח זה מתאר את היישום של פלואורומטריה תפקודית מכוונת אתר בתאי שרירי שלד בוגרים כדי לחקור את השלבים המוקדמים של צימוד עירור-כיווץ, התהליך שבו דפולריזציה חשמלית של סיבי שריר קשורה להפעלת התכווצות שרירים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המתודולוגיות לתכנון והעברה של תעלות Ca2+ מגודרות מתח מהונדסות ציסטאין (CaV1.1) לסיבי שריר של flexor digitorum brevis של עכברים בוגרים באמצעות אלקטרופורציה in vivo ואת השלבים הבאים הדרושים למדידות פלואורומטריה פונקציונאליות מכוונות אתר. גישה זו יכולה להיות מותאמת לחקר תעלות יונים וחלבונים אחרים. השימוש בפלאורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר של שרירי יונקים רלוונטי במיוחד לחקר מנגנונים בסיסיים של עוררות.
היכולת לעקוב אחר סידורים קונפורמטיביים של תעלות יונים בתגובה לגירוי חשמלי ידוע בתא חי היא מקור למידע רב ערך עבור פיזיולוגיה מולקולרית1. תעלות יונים מגודרות מתח הן חלבוני ממברנה החשים שינויים במתח הטרנסממברנלי, ותפקידם מושפע גם משינויי מתח2. התפתחות טכניקות מהדק מתח במאה הקודמת אפשרה לפיזיולוגים לחקור, בזמן אמת, זרמים יוניים הנישאים על ידי תעלות יונים מגודרות מתח בתגובה לדפולריזציה של הממברנה3. השימוש בטכנולוגיית מהדק מתח היה חיוני להבנת התכונות החשמליות של תאים מעוררים כגון נוירונים ושרירים. בשנות ה-70 של המאה ה-20, עידון מהדק המתח איפשר זיהוי זרמי גאטינג (או תנועת מטען) בתעלות סידן מגודרות מתח (Ca V) ונתרן (NaV) 4,5. זרמי גאטינג הם זרמים קיבוליים לא ליניאריים הנובעים מתנועת חיישני מתח בתגובה לשינויים בשדה החשמלי על פני קרום התא6. זרמי גאטינג נחשבים לביטוי חשמלי של סידורים מולקולריים המקדימים או מלווים את פתיחת תעלת היונים7. בעוד מדידות זרם אלה מספקות מידע רב ערך לגבי תפקוד הערוץ, הן זרמים יוניים והן זרמי גטינג הם קריאות עקיפות של סידורים קונפורמטיביים בין-מולקולריים ותוך-מולקולריים של תעלות מגודרות מתח7.
פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר (FSDF; מכונה גם פלואורומטריית מהדק מתח, VCF) פותחה בתחילת שנות התשעים8 וסיפקה לראשונה את היכולת לצפות ישירות בשינויים קונפורמטיביים מקומיים ואת תפקודו של חלבון ערוץ בזמן אמת. באמצעות שילוב של מוטגנזה של תעלות, אלקטרופיזיולוגיה ומערכות ביטוי הטרולוגיות, ניתן לתייג ולעקוב באופן פלואורסצנטי אחר החלקים הנעים של ערוצים או קולטנים ספציפיים בתגובה לגירוי המפעיל 9,10. גישה זו שימשה באופן נרחב לחקר מנגנוני חישת המתח בתעלות יונים מגודרות מתח 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. לקבלת סקירות סמכותיות, ראה 10,20,21,22,23.
תעלות Ca V ו-NaV, הקריטיות להפעלה והתפשטות של אותות חשמליים, מורכבות מתת-יחידה ראשית α1, בעלת נקבובית מרכזית וארבעה תחומי חישת מתח לא זהים2. בנוסף למבנה הראשוני הייחודי שלהם, ערוצי Ca V ו- NaV מבוטאים כקומפלקסים מרובי יחידות עם יחידות משנה עזר24. תעלות אשלגן תלויות מתח (K V) מורכבות מארבע תת-יחידות שנראות כמו תחום אחד של Na V או CaV25. תת-היחידה α1 יוצרת נקבוביות וחישת מתח של תעלות Ca V ו-NaV נוצרת על ידי קידוד פוליפפטיד יחיד עבור ארבעה תחומים נפרדים של שישה מקטעים טרנסממברנליים ייחודיים (S1-S6; איור 1A) 24,26. האזור המורכב ממקטעי טרנסממברנה S1 עד S4 יוצרים את תחום חישת המתח (VSD) ומקטעי טרנסממברנה S5 ו-S6 יוצרים את תחום הנקבוביות26. בכל VSD, סליל α S4 מכיל ארגינין או ליזין בעלי מטען חיובי (איור 1A,B) שנעים בתגובה לדפולריזציה של הממברנה7. כמה עשורים של מחקר ותוצאות מגישות ניסיוניות מגוונות ביותר תומכות בהנחה שמקטעי S4 נעים החוצה ויוצרים זרמי גטינג, בתגובה לדפולריזציה של הממברנה6.
FSDF מודד את השינויים הפלואורסצנטיים של צבע תגובתי תיול המצומד לשאריות ציסטאין ספציפיות (כלומר, סליל α S4) על תעלת יונים או חלבון אחר, שהונדסו באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר, כאשר התעלה מתפקדת בתגובה לדפולריזציה של הממברנה או גירויים אחרים10. למעשה, FSDF פותח במקור כדי לחקור אם מקטע S4 בערוצי KV, שהוצע להיות חיישן המתח העיקרי של הערוץ, נע כאשר מטעני הגאטינג נעים בתגובה לשינויים בפוטנציאל הממברנה 8,10. במקרה של תעלות יונים מגודרות מתח, FSDF יכול לפתור סידורים קונפורמטיביים עצמאיים של ארבעת ה-VSD (מעקב אחר VSD אחד בכל זמן נתון), במקביל למדידות של פונקציית הערוץ. ואכן, באמצעות גישה זו, הוכח כי VSDs בודדים נראים מעורבים באופן דיפרנציאלי בהיבטים ספציפיים של הפעלת ערוץ והשבתה 12,27,28,29,30. זיהוי התרומה של כל VSD לתפקוד הערוצים הוא בעל רלוונטיות גבוהה וניתן להשתמש בו כדי להבהיר עוד יותר את פעולת הערוץ ואולי לזהות מטרות חדשות לפיתוח תרופות.
השימוש ב-FSDF במערכות ביטוי הטרולוגיות סייע רבות בקידום הבנתנו את תפקוד הערוץ מנקודת מבט רדוקציוניסטית10,23. כמו גישות רדוקציוניסטיות רבות, היא מציגה יתרונות אך יש לה גם מגבלות. לדוגמה, מגבלה עיקרית אחת היא בנייה מחדש חלקית של סביבת ננו התעלה במערכת ההטרולוגית. לעתים קרובות, תעלות יונים מתקשרות עם תת-יחידות עזר רבות וחלבונים רבים אחרים המשנים את תפקידם31. באופן עקרוני, תעלות שונות ותת-היחידות הנלוות שלהן יכולות לבוא לידי ביטוי במערכות הטרולוגיות תוך שימוש במבני קידוד חלבונים מרובים או פלסמידים פוליציסטרוניים, אך לא ניתן לשחזר את סביבתם הטבעית במלואה30,32.
הקבוצה שלנו פרסמה לאחרונה גרסה של FSDF בסיבי שריר שלד מנותקים טבעיים לחקר השלבים המוקדמים של צימוד עירור-כיווץ (ECC)33,34, התהליך שבו דפולריזציה חשמלית של סיבי שריר קשורה להפעלת כיווץ שריר 35,36. בפעם הראשונה, גישה זו אפשרה מעקב תנועה של חיישני מתח S4 בודדים מערוץ Ca2+ מגודר מתח מסוג L (CaV1.1, הידוע גם בשם DHPR) בסביבה הטבעית של סיב שריר מובחןבוגר 37. מטרה זו הושגה על ידי התחשבות במאפיינים רבים של סוג תא זה, כולל הפעילות החשמלית של התא המאפשרת דפולריזציה מהירה המושרה על ידי גירוי עצמי, היכולת לבטא פלסמיד cDNA באמצעות אלקטרופורציה in vivo, הביטוי הגבוה הטבעי והארגון המידור של התעלות בתוך התא, והתאמתו למכשירי הדמיה והקלטה אלקטרופיזיולוגית במהירות גבוהה. בעבר, השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת קווים במהירות גבוהה כמכשיר גילוי37. כעת, וריאציה של הטכניקה מוצגת באמצעות פוטודיודה לקליטת אותות. מערכת זיהוי מבוססת פוטודיודות זו יכולה להקל על יישום טכניקה זו במעבדות אחרות.
כאן מתואר פרוטוקול שלב אחר שלב לניצול FSDF בתאים מקוריים לחקר תנועת חיישן מתח בודד מ- CaV1.1. בעוד ערוץ CaV1.1 שימש כדוגמה לאורך כל כתב היד הזה, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על תחומים נגישים מחוץ לתא של תעלות יונים אחרות, קולטנים, או חלבונים פני השטח.
כאן מתואר פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע FSDF בסיבי שריר לחקר תנועות חיישן מתח בודדות מערוץ CaV1.1. למרות שמספר השלבים ומגוון הגישות המשולבות בטכניקה זו עשויים להיראות מורכבים, רוב הטכניקות הללו משמשות לעתים קרובות באופן שגרתי במעבדות ביופיזיקאיות / ביולוגיות של התא. לפיכך, המורכבות לכאורה…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לד”ר ג’יי ורגרה (אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג’לס) על שיתוף פלסמיד הבר מסוג EGFP-CaV1.1 (ארנב). אנו מודים למעבדת האלקטרוניקה של המחלקה לפיזיולוגיה של ייל ובמיוחד להנריק אבילגארד על התכנון והבנייה של הפוטודיודה עם מעגל מסילה והחזקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01-AR075726 ו- R01-NS103777
Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated |
glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
Photodiode | Custom Made | NA | |
PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacyte field stimulation electrode |
Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
Voltage generator | Custom Made | NA |