Summary

Una técnica simple para evaluar la actividad locomotora en Drosophila

Published: February 24, 2023
doi:

Summary

El presente protocolo evalúa la actividad locomotora de Drosophila mediante el seguimiento y análisis del movimiento de las moscas en una arena hecha a mano utilizando el software de código abierto Fiji, compatible con plugins para segmentar píxeles de cada fotograma basado en grabación de vídeo de alta definición para calcular parámetros de velocidad, distancia, etc.

Abstract

Drosophila melanogaster es un organismo modelo ideal para estudiar diversas enfermedades debido a su abundancia de técnicas avanzadas de manipulación genética y diversas características de comportamiento. La identificación de la deficiencia de comportamiento en modelos animales es una medida crucial de la gravedad de la enfermedad, por ejemplo, en enfermedades neurodegenerativas donde los pacientes a menudo experimentan deficiencias en la función motora. Sin embargo, con la disponibilidad de varios sistemas para rastrear y evaluar los déficits motores en modelos de moscas, como individuos tratados con drogas o transgénicos, todavía falta un sistema económico y fácil de usar para una evaluación precisa desde múltiples ángulos. Aquí se desarrolla un método basado en la interfaz de programación de aplicaciones (API) AnimalTracker , que es compatible con el programa de procesamiento de imágenes de Fiji, para evaluar sistemáticamente las actividades de movimiento de individuos adultos y larvales a partir de video grabado, lo que permite el análisis de su comportamiento de rastreo. Este método requiere solo una cámara de alta definición y una integración de hardware periférico de computadora para registrar y analizar el comportamiento, lo que lo convierte en un enfoque asequible y efectivo para detectar modelos de moscas con deficiencias de comportamiento transgénicas o ambientales. Se dan ejemplos de pruebas de comportamiento con moscas tratadas farmacológicamente para mostrar cómo las técnicas pueden detectar cambios de comportamiento tanto en moscas adultas como en larvas de una manera altamente repetible.

Introduction

Drosophila melanogaster proporciona un excelente organismo modelo para investigar las funciones celulares y moleculares en modelos de enfermedades neuronales creados por modificación génica1, tratamiento farmacológico2 y senescencia3. La alta conservación de las vías biológicas, las propiedades físicas y los genes homólogos asociados a enfermedades entre los humanos y Drosophila hacen que la mosca de la fruta sea una imitación ideal desde el nivel molecular hasta el nivel de comportamiento4. En muchos modelos de enfermedad, la deficiencia conductual es un índice importante, proporcionando un modelo útil para diversas neuropatías humanas 5,6. Drosophila ahora se utiliza para estudiar múltiples enfermedades humanas, neurodesarrollo y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica 7,8. La detección de la capacidad motora de los modelos de enfermedad es crucial para comprender el progreso patogénico y puede proporcionar una correlación fenotípica con los mecanismos moleculares subyacentes al proceso de la enfermedad.

Recientemente, se han desarrollado herramientas de software disponibles comercialmente y programas rentables para las estrategias de detección locomotora de Drosophila, como las pruebas de alto rendimiento en moscas agrupadas9,10 y la medición de la locomoción en tiempo real11,12. Uno de estos enfoques convencionales es la geotaxis negativa interactiva rápida (RING), también llamada ensayo de escalada, que incluye múltiples canales que permiten contener una gran población de moscas con el mismo sexo y edad, reduciendo la variación mientras se recopilan datos 9,13. Otro método de prueba previa para analizar el comportamiento locomotor es el monitor de actividad TriKinetics Drosophila (DAM), un dispositivo que utiliza múltiples haces para detectar el movimiento de la actividad de la mosca dentro de un tubo de vidrio delgado14. El dispositivo registra la posición continuamente, lo que representa la locomoción automatizada mediante el cálculo de los cruces de haces para estudiar la actividad y el ritmo circadiano de las moscas durante un período de tiempo más largo15. Aunque estos métodos se han utilizado ampliamente en el análisis de defectos de comportamiento en moscas de la fruta para determinar cambios en la locomoción conductual, siempre requieren equipos de prueba especiales o procesos de análisis complejos, y restringen su aplicación en algunos modelos con un dispositivo limitado y simple. Las estrategias grupales de rastreo de animales para probar la Drosófila adulta, como FlyGrAM11 y el ensayo de la isla Drosophila 10, implementan el reclutamiento social y el seguimiento individual en un área predefinida. Sin embargo, la restricción social individual en áreas desafiadas podría tener un efecto negativo en las identificaciones en las imágenes, causado por la colisión o superposición de moscas. Aunque algunos métodos basados en materiales de código abierto, como TRex16, MARGO 12 y FlyPi17, tienen una emergencia, pueden rastrear rápidamente las moscas con un uso flexible en las pruebas de comportamiento. Estos enfoques de prueba están asociados con instalaciones de aparatos experimentales elaborados, requisitos especiales de software o lenguajes informáticos profesionales. Para las larvas, medir la distancia total recorrida a través del número de líneas de borde de cuadrícula por unidad de tiempo18, o contar las contracciones de la pared corporal para individuos manualmente19, son los métodos predominantes para evaluar su capacidad locomotora. Debido a la falta de precisión en equipos o dispositivos y métodos de análisis, alguna locomoción conductual de las larvas podría escapar a la detección, lo que dificulta la evaluación precisa del movimiento conductual, especialmente el movimiento fino15.

El presente método desarrollado utiliza la interfaz de programación de aplicaciones (API) AnimalTracker , compatible con el programa de procesamiento de imágenes Fiji (ImageJ), para evaluar sistemáticamente la actividad locomotora de moscas adultas y larvales mediante el análisis de su comportamiento de seguimiento a partir de videos de alta definición (HD). Fiji es una distribución de software de código abierto ImageJ que puede combinar bibliotecas de software robustas con numerosos lenguajes de scripting, lo que resulta en la creación rápida de prototipos de algoritmos de procesamiento de imágenes, lo que la hace popular entre los biólogos por sus capacidades de análisis de imágenes20. En el enfoque actual, la integración de Fiji en la API AnimalTracker se explota para desarrollar un ensayo de comportamiento único de Drosophila con inserción de algoritmo personalizado, y proporciona un paso útil para documentación detallada y tutoriales para respaldar capacidades analíticas sólidas del comportamiento locomotor (Figura 1). Para evitar la complicación de las identificaciones objetivas en las imágenes causadas por la colisión o superposición de moscas, cada arena está restringida a albergar solo una mosca. Al evaluar la precisión de seguimiento del enfoque, se implementó para rastrear y cuantificar los movimientos locomotores de Drosophila que fueron administrados con el fármaco tóxico rotenona, que generalmente se utiliza para modelos animales de la enfermedad de Parkinson, descubriendo finalmente el deterioro de la locomoción en el tratamiento farmacológico21. Esta metodología, que emplea software libre y de código abierto, no necesita instrumentación de alto costo y puede analizar de manera precisa y reproducible la locomoción conductual de Drosophila .

Protocol

W1118 moscas adultas y larvas del tercer estadio se utilizaron para el presente estudio. 1. Preparación experimental NOTA: Una arena de campo abierto para el seguimiento de locomoción de Drosophila está hecha con un gel de sílice incoloro e inodoro. Mezcle el reactivo A y el reactivo B en una proporción de 1:10, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el kit de sílice (consulte la Tab…

Representative Results

En el presente estudio, se examinaron los déficits locomotores en moscas adultas y larvas de tercer estadio tratadas con rotenona y se compararon en su actividad motora con la de una mosca control alimentada con el disolvente dimetilsulfóxido (DMSO). Se ha demostrado que el tratamiento con rotenona en Drosophila causa pérdida de neuronas dopaminérgicas en el cerebro22 y conduce a déficits locomotores significativos23. Como se muestra en la Figura <strong class…

Discussion

Hemos diseñado un método, basado en el material de código abierto AnimalTracker API compatible con el programa de procesamiento de imágenes de Fiji, que puede permitir a los investigadores evaluar sistemáticamente la actividad locomotora mediante el seguimiento de larvas adultas e individuales. AnimalTracke es una herramienta escrita en Java que puede integrarse fácilmente en bases de datos existentes u otras herramientas para facilitar el análisis del comportamiento de seguimiento de animales di…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por un fondo de lanzamiento especial de la Universidad de Soochow y la Fundación Nacional de Ciencias de China (NSFC) (82171414). Agradecemos a los miembros del laboratorio del Prof. Chunfeng Liu por su discusión y comentarios.

Materials

Animal tracker Hungarian Brain Research Program version: 1.7 pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software Microsoft version: 2021.105.10.0 built-in windows 10 system
Computer DELL Vostro-14-5480 a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation Wu han Yihong technology #YHDFPCO2-018 official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software Fiji team version: 1.53v official website: https://fiji.sc/
Format factory software Pcfreetime version: X64 5.4.5 official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism GraphPad Software version: 8.0.2 official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera TTQ Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software Microsoft version: office 2019 official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish Bkman 110301003 size: 60 mm
Silica gel DOW SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate Macklin #144-55-8 Mix well with silica gel

References

  1. Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson’s disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
  2. Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
  3. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
  4. Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
  5. Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
  6. Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer’s disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
  7. Dung, V. M., Thao, D. T. P. Parkinson’s disease model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 41-61 (2018).
  8. Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
  9. Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
  10. Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
  11. Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
  12. Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
  13. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
  14. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
  15. McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
  16. Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
  17. Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
  18. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  19. Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson’s disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
  22. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
  23. Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
  24. Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
  25. Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
  26. Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).

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Cite This Article
Long, X., Du, H., Jiang, M., Meng, H. A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (192), e65092, doi:10.3791/65092 (2023).

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