Summary

Eine einfache Technik zur Bestimmung der lokomotorischen Aktivität in Drosophila

Published: February 24, 2023
doi:

Summary

Das vorliegende Protokoll bewertet die Bewegungsaktivität von Drosophila , indem es die Bewegung von Fliegen in einer handgefertigten Arena unter Verwendung der Open-Source-Software Fidschi verfolgt und analysiert, die mit Plugins kompatibel ist, um Pixel jedes Frames basierend auf hochauflösenden Videoaufzeichnungen zu segmentieren, um Parameter wie Geschwindigkeit, Entfernung usw. zu berechnen.

Abstract

Drosophila melanogaster ist aufgrund seiner Fülle an fortschrittlichen genetischen Manipulationstechniken und vielfältigen Verhaltensmerkmalen ein idealer Modellorganismus für die Erforschung verschiedener Krankheiten. Die Identifizierung von Verhaltensstörungen in Tiermodellen ist ein entscheidendes Maß für den Schweregrad der Erkrankung, zum Beispiel bei neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen Patienten häufig Beeinträchtigungen der Motorik erfahren. Mit der Verfügbarkeit verschiedener Systeme zur Verfolgung und Bewertung motorischer Defizite in Fliegenmodellen, wie z. B. medikamentös behandelten oder transgenen Individuen, fehlt jedoch noch ein wirtschaftliches und benutzerfreundliches System zur präzisen Auswertung aus mehreren Blickwinkeln. Hier wird eine Methode entwickelt, die auf dem Application-Programming Interface (API) AnimalTracker basiert und mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm kompatibel ist, um die Bewegungsaktivitäten sowohl adulter als auch larvaler Individuen aus aufgezeichneten Videos systematisch auszuwerten und so deren Tracking-Verhalten zu analysieren. Diese Methode erfordert nur eine hochauflösende Kamera und eine Hardwareintegration für Computerperipheriegeräte, um das Verhalten aufzuzeichnen und zu analysieren, was sie zu einem erschwinglichen und effektiven Ansatz für das Screening von Fliegenmodellen mit transgenen oder umweltbedingten Verhaltensmängeln macht. Beispiele für Verhaltenstests mit pharmakologisch behandelten Fliegen werden gegeben, um zu zeigen, wie die Techniken Verhaltensänderungen sowohl bei erwachsenen Fliegen als auch bei Larven auf hochgradig wiederholbare Weise erkennen können.

Introduction

Drosophila melanogaster ist ein hervorragender Modellorganismus für die Untersuchung zellulärer und molekularer Funktionen in neuronalen Krankheitsmodellen, die durch Genmodifikation1, medikamentöse Behandlung2 und Seneszenz3 entstanden sind. Die hohe Erhaltung biologischer Signalwege, physikalischer Eigenschaften und krankheitsassoziierter Homologgene zwischen Mensch und Drosophila macht die Fruchtfliege zu einem idealen Nachahmer von der molekularen bis zur Verhaltensebene4. In vielen Krankheitsmodellen ist die Verhaltensschwäche ein wichtiger Index, der ein hilfreiches Modell für verschiedene menschliche Neuropathien darstellt 5,6. Drosophila wird heute verwendet, um mehrere menschliche Krankheiten, die neurologische Entwicklung und neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson und amyotrophe Lateralsklerose zu untersuchen 7,8. Die Detektion der motorischen Fähigkeiten der Krankheitsmodelle ist entscheidend für das Verständnis des pathogenen Verlaufs und könnte eine phänotypische Korrelation zu den molekularen Mechanismen liefern, die dem Krankheitsprozess zugrunde liegen.

In jüngster Zeit wurden kommerziell erhältliche Software-Tools und kostengünstige Programme für Strategien zur Detektion des Bewegungsapparates von Drosophila entwickelt, wie z. B. Hochdurchsatztests in gruppierten Fliegen9,10 und Messungen der Fortbewegung in Echtzeit11,12. Ein solcher konventioneller Ansatz ist die schnelle interaktive negative Geotaxis (RING), auch Kletterassay genannt, der mehrere Kanäle umfasst, die es ermöglichen, eine große Fliegenpopulation mit gleichem Geschlecht und Alter einzudämmen, wodurch die Variation reduziert wird, während die Daten gesammelt werden 9,13. Ein weiteres Vortestverfahren zur Analyse des Bewegungsverhaltens ist der TriKinetics Drosophila Activity Monitor (DAM), eine Vorrichtung, die mehrere Strahlen verwendet, um die Bewegung der Fliegenaktivität innerhalb eines dünnen Glasröhrchens14 zu erfassen. Die Vorrichtung zeichnet kontinuierlich die Position auf, die eine automatisierte Fortbewegung darstellt, indem die Strahlkreuzungen berechnet werden, um die Aktivität und den circadianen Rhythmus von Fliegen über einen längeren Zeitraum zu untersuchen15. Obwohl diese Methoden bei der Analyse von Verhaltensfehlern bei Fruchtfliegen weit verbreitet sind, um Veränderungen in der Verhaltensfortbewegung zu bestimmen, erfordern sie immer spezielle Testgeräte oder komplexe Analyseprozesse und schränken ihre Anwendung in einigen Modellen mit einem begrenzten, einfachen Gerät ein. Gruppenbasierte Strategien zur Tierverfolgung zum Testen der adulten Drosophila, wie z. B. FlyGrAM11 und der Drosophila Island Assay10, implementieren soziale Rekrutierung und individuelles Tracking in einem vordefinierten Bereich. Nichtsdestotrotz können sich soziale individuelle Einschränkungen in benachteiligten Gebieten negativ auf die Identifizierung in den Bildern auswirken, verursacht durch die Kollision oder Überlappung von Fliegen. Auch wenn einige materialbasierte Open-Source-Methoden wie TRex16, MARGO 12 und FlyPi17 einen Notfall haben, können sie die Fliegen mit flexiblem Einsatz in Verhaltenstests schnell verfolgen. Diese Testansätze sind mit aufwendigen Versuchsapparaturen, speziellen Softwareanforderungen oder professionellen Computersprachen verbunden. Bei Larven sind die Messung der Gesamtstrecke, die über die Anzahl der Gitterbegrenzungslinien pro Zeiteinheit18 zurückgelegt wird, oder die grobe Zählung der Körperwandkontraktionen für Individuen19 die vorherrschenden Methoden zur Beurteilung ihrer Bewegungsfähigkeit. Aufgrund der mangelnden Präzision von Geräten oder Vorrichtungen und Analysemethoden kann es vorkommen, dass einige Verhaltensbewegungen von Larven nicht entdeckt werden, was es schwierig macht, Verhaltensbewegungen, insbesondere feine Bewegungen, genau zu beurteilen15.

Die hier entwickelte Methode nutzt die AnimalTracker-Programmierschnittstelle (API), die mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm (ImageJ) kompatibel ist, um die Bewegungsaktivität sowohl von adulten als auch von Larvenfliegen systematisch zu bewerten, indem ihr Tracking-Verhalten aus hochauflösenden (HD) Videos analysiert wird. Fiji ist eine Open-Source-Software-ImageJ-Distribution, die robuste Softwarebibliotheken mit zahlreichen Skriptsprachen kombinieren kann, was zu einem schnellen Prototyping von Bildverarbeitungsalgorithmen führt, was sie bei Biologen wegen ihrer Bildanalysefunktionen beliebt macht20. Im aktuellen Ansatz wird die Integration von Fidschi in die AnimalTracker-API genutzt, um einen einzigartigen Drosophila-Verhaltensassay mit personalisierter Algorithmus-Einfügung zu entwickeln, und bietet einen nützlichen Schritt für detaillierte Dokumentationen und Tutorials, um robuste analytische Fähigkeiten des Bewegungsverhaltens zu unterstützen (Abbildung 1). Um die Komplikation der objektiven Identifizierung in den Bildern zu umgehen, die durch die Kollision oder Überlappung von Fliegen verursacht wird, ist jede Arena darauf beschränkt, nur eine Fliege zu beherbergen. Nach der Bewertung der Tracking-Präzision des Ansatzes wurde er implementiert, um die Bewegungsbewegungen von Drosophila zu verfolgen und zu quantifizieren, die mit dem toxischen Medikament Rotenon verabreicht wurden, das im Allgemeinen für Tiermodelle der Parkinson-Krankheit verwendet wird, und schließlich eine Beeinträchtigung der Fortbewegung in der medikamentösen Behandlung entdeckte21. Diese Methodik, die Open-Source- und freie Software verwendet, erfordert keine kostspieligen Instrumente und kann die Verhaltensbewegung von Drosophila präzise und reproduzierbar analysieren.

Protocol

Für die vorliegende Studie wurden W1118 adulte Fliegen und Larven im dritten Stadium verwendet. 1. Versuchsvorbereitung HINWEIS: Eine Freilandarena für die Fortbewegungsverfolgung von Drosophila besteht aus einem farb- und geruchlosen Kieselgel. Mischen Sie Reagenz A und Reagenz B im Verhältnis 1:10 gemäß den Anweisungen des Herstellers für das Kieselsäure-Kit (siehe Materialtabelle). St…

Representative Results

In der vorliegenden Arbeit wurden lokomotorische Defizite bei adulten Fliegen und Larven im dritten Stadium, die mit Rotenon behandelt wurden, untersucht und in ihrer motorischen Aktivität mit der einer Kontrollfliege verglichen, die mit dem Wirkstofflösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) gefüttert wurde. Es hat sich gezeigt, dass die Behandlung mit Rotenon bei Drosophila zu einem Verlust von dopaminergen Neuronen im Gehirn führt22 und zu signifikanten lokomotorischen Defiziten<sup cla…

Discussion

Wir haben eine Methode entwickelt, die auf dem Open-Source-Material AnimalTracker API basiert, das mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm kompatibel ist und es Forschern ermöglicht, die Bewegungsaktivität systematisch zu bewerten, indem sie sowohl erwachsene als auch einzelne Larvenfliegen verfolgen. AnimalTracke ist ein in Java geschriebenes Tool, das sich leicht in bestehende Datenbanken oder andere Tools integrieren lässt, um die Analyse des von der Anwendung entworfenen Tierverfolgungsverhalte…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen speziellen Startfonds der Soochow-Universität und der National Science Foundation of China (NSFC) (82171414) unterstützt. Wir danken den Labormitgliedern von Prof. Chunfeng Liu für ihre Diskussionen und Kommentare.

Materials

Animal tracker Hungarian Brain Research Program version: 1.7 pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software Microsoft version: 2021.105.10.0 built-in windows 10 system
Computer DELL Vostro-14-5480 a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation Wu han Yihong technology #YHDFPCO2-018 official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software Fiji team version: 1.53v official website: https://fiji.sc/
Format factory software Pcfreetime version: X64 5.4.5 official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism GraphPad Software version: 8.0.2 official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera TTQ Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software Microsoft version: office 2019 official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish Bkman 110301003 size: 60 mm
Silica gel DOW SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate Macklin #144-55-8 Mix well with silica gel

References

  1. Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson’s disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
  2. Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
  3. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
  4. Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
  5. Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
  6. Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer’s disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
  7. Dung, V. M., Thao, D. T. P. Parkinson’s disease model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 41-61 (2018).
  8. Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
  9. Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
  10. Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
  11. Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
  12. Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
  13. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
  14. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
  15. McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
  16. Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
  17. Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
  18. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  19. Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson’s disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
  22. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
  23. Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
  24. Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
  25. Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
  26. Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).

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Cite This Article
Long, X., Du, H., Jiang, M., Meng, H. A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (192), e65092, doi:10.3791/65092 (2023).

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