Summary

Простой метод анализа двигательной активности дрозофилы

Published: February 24, 2023
doi:

Summary

Настоящий протокол оценивает локомоторную активность дрозофилы путем отслеживания и анализа движения мух на самодельной арене с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом Fiji, совместимого с плагинами для сегментации пикселей каждого кадра на основе видеозаписи высокой четкости для расчета параметров скорости, расстояния и т.д.

Abstract

Drosophila melanogaster является идеальным модельным организмом для изучения различных заболеваний благодаря обилию передовых методов генетических манипуляций и разнообразным поведенческим особенностям. Выявление поведенческого дефицита на животных моделях является важнейшим показателем тяжести заболевания, например, при нейродегенеративных заболеваниях, когда пациенты часто испытывают нарушения двигательной функции. Однако при наличии различных систем для отслеживания и оценки двигательного дефицита в моделях мух, таких как лекарственные препараты или трансгенные люди, по-прежнему отсутствует экономичная и удобная для пользователя система для точной оценки с разных точек зрения. Здесь разработан метод, основанный на интерфейсе прикладного программирования (API) AnimalTracker , который совместим с программой обработки изображений Фиджи, для систематической оценки двигательной активности как взрослых, так и личиночных особей по записанному видео, что позволяет анализировать их поведение при отслеживании. Этот метод требует только камеры высокой четкости и интеграции компьютерного периферийного оборудования для записи и анализа поведения, что делает его доступным и эффективным подходом для скрининга моделей мух с трансгенными или экологическими поведенческими недостатками. Приведены примеры поведенческих тестов с использованием фармакологически обработанных мух, чтобы показать, как методы могут обнаруживать поведенческие изменения как у взрослых мух, так и у личинок с высокой повторяемостью.

Introduction

Drosophila melanogaster является отличным модельным организмом для исследования клеточных и молекулярных функций в моделях нейрональных заболеваний, созданных с помощью модификациигенов 1, медикаментозного лечения2 и старения3. Высокая степень сохранности биологических путей, физических свойств и генов-гомологов, связанных с заболеванием, между человеком и дрозофилой делает плодовую мушку идеальным подражателем от молекулярного до поведенческого уровня4. Во многих моделях заболеваний поведенческий дефицит является важным показателем, обеспечивающим полезную модель для различных невропатийчеловека 5,6. Дрозофила в настоящее время используется для изучения множества заболеваний человека, развития нервной системы и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз 7,8. Обнаружение двигательной способности моделей заболевания имеет решающее значение для понимания патогенного прогресса и может обеспечить фенотипическую корреляцию с молекулярными механизмами, лежащими в основе процесса заболевания.

В последнее время были разработаны коммерчески доступные программные инструменты и экономически эффективные программы для стратегий обнаружения локомотора дрозофилы, такие как высокопроизводительные испытания на сгруппированных мухах9,10 и измерение локомоции в режиме реального времени11,12. Одним из таких традиционных подходов является быстрый интерактивный отрицательный геотаксис (RING), также называемый альпинистским анализом, который включает в себя несколько каналов, которые позволяют сдерживать большую популяцию мух того же пола и возраста, уменьшая вариации при сборе данных 9,13. Другим методом предварительного тестирования для анализа двигательного поведения является монитор активности дрозофилы TriKinetics (DAM), устройство, которое использует несколько лучей для обнаружения движения активности мух в тонкой стеклянной трубке14. Устройство непрерывно регистрирует положение, которое представляет собой автоматическую локомоцию путем вычисления пересечений лучей для изучения активности и циркадного ритма мух в течение более длительного периода времени15. Хотя эти методы широко используются при анализе поведенческих дефектов у плодовых мушек для определения изменений в поведенческой локомоции, они всегда требуют специального испытательного оборудования или сложных процессов анализа и ограничивают их применение в некоторых моделях с ограниченным, простым устройством. Групповые стратегии по отслеживанию животных для тестирования взрослых дрозофил, такие как FlyGrAM11 и анализ острова Drosophila 10, реализуют социальный набор и индивидуальное отслеживание в заранее определенной области. Тем не менее, социальные индивидуальные ограничения в неконтролируемых районах могут оказать негативное влияние на идентификацию на изображениях, вызванную столкновением или перекрытием мух. Несмотря на то, что некоторые методы, основанные на материалах с открытым исходным кодом, такие как TRex16, MARGO 12 и FlyPi17, имеют чрезвычайную ситуацию, они могут быстро отслеживать мух с гибким использованием в поведенческом тестировании. Эти подходы к тестированию связаны со сложными экспериментальными установками, специальными требованиями к программному обеспечению или профессиональными компьютерными языками. Для личинок измерение общего расстояния, пройденного по количеству пограничных линий сетки в единицу времени18, или грубый подсчет сокращений стенок тела для особей вручную19 являются преобладающими методами оценки их двигательных способностей. Из-за отсутствия точности в оборудовании или устройствах и методах анализа некоторые поведенческие локомоции личинок могут ускользнуть от обнаружения, что затрудняет точную оценку поведенческих движений, особенно тонких движений15.

В настоящем разработанном способе используется интерфейс прикладного программирования (API) AnimalTracker , совместимый с программой обработки изображений Fiji (ImageJ), для систематической оценки двигательной активности как взрослых, так и личинок мух путем анализа их поведения при отслеживании видео высокой четкости (HD). Fiji — это дистрибутив программного обеспечения ImageJ с открытым исходным кодом, который может сочетать надежные программные библиотеки с многочисленными языками сценариев, что приводит к быстрому прототипированию алгоритмов обработки изображений, что делает его популярным среди биологов благодаря своим возможностям анализа изображений20. В текущем подходе интеграция Фиджи в API AnimalTracker используется для разработки уникального поведенческого анализа дрозофилы с персонализированной вставкой алгоритма и обеспечивает полезный шаг для подробной документации и учебных пособий для поддержки надежных аналитических возможностей локомоторного поведения (рис. 1). Чтобы избежать усложнения объективной идентификации на изображениях, вызванного столкновением или перекрытием мух, каждая арена ограничена приемом только одной мухи. После оценки точности отслеживания подхода был реализован для отслеживания и количественной оценки локомоторных движений дрозофилы , которые вводили с токсичным препаратом ротеноном, который обычно используется для животных моделей болезни Паркинсона, в конечном итоге обнаружив нарушение локомоции при медикаментозном лечении21. Эта методология, использующая открытое и свободное программное обеспечение, не требует дорогостоящих инструментов и может точно и воспроизводимо анализировать поведенческую локомоцию дрозофилы .

Protocol

Для настоящего исследования использовали W 1118 взрослых мух и личинок третьего возраста. 1. Экспериментальная подготовка ПРИМЕЧАНИЕ: Открытая арена для отслеживания локомоции дрозофилы изготовлена из бесцветного силикагеля без зап…

Representative Results

В настоящем исследовании был изучен двигательный дефицит у взрослых мух и личинок третьего возраста, обработанных ротеноном, и их двигательная активность сравнивалась с таковой у контрольной мухи, получавшей лекарственный растворитель диметилсульфоксид (ДМСО). Было показано, что леч?…

Discussion

Мы разработали метод, основанный на материалах с открытым исходным кодом AnimalTracker API, совместимых с программой обработки изображений Фиджи, который может позволить исследователям систематически оценивать двигательную активность, отслеживая как взрослых, так и отдельных личинок м?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана специальным стартовым фондом Университета Сучжоу и Национальным научным фондом Китая (NSFC) (82171414). Мы благодарим сотрудников лаборатории профессора Чуньфэн Лю за их обсуждение и комментарии.

Materials

Animal tracker Hungarian Brain Research Program version: 1.7 pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software Microsoft version: 2021.105.10.0 built-in windows 10 system
Computer DELL Vostro-14-5480 a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation Wu han Yihong technology #YHDFPCO2-018 official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software Fiji team version: 1.53v official website: https://fiji.sc/
Format factory software Pcfreetime version: X64 5.4.5 official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism GraphPad Software version: 8.0.2 official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera TTQ Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software Microsoft version: office 2019 official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish Bkman 110301003 size: 60 mm
Silica gel DOW SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate Macklin #144-55-8 Mix well with silica gel

References

  1. Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson’s disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
  2. Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
  3. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
  4. Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
  5. Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
  6. Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer’s disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
  7. Dung, V. M., Thao, D. T. P. Parkinson’s disease model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 41-61 (2018).
  8. Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
  9. Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
  10. Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
  11. Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
  12. Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
  13. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
  14. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
  15. McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
  16. Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
  17. Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
  18. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  19. Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson’s disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
  22. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
  23. Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
  24. Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
  25. Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
  26. Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).

Play Video

Cite This Article
Long, X., Du, H., Jiang, M., Meng, H. A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (192), e65092, doi:10.3791/65092 (2023).

View Video